张秋爽，张国珍*，李大波，张国财

(1.东北林业大学，哈尔滨150040；2.红花尔基林业局)

在植物生存环境受到诸如干旱、温度、病虫害、土壤pH、金属的胁迫时，就会产生大量活性氧，活性氧量与抗氧化系统间的平衡就会被打破，对植物造成损伤[1]。在环境胁迫初期，植物体内的抗氧化物质上升，自身会产生一定的保护性反应，酶促防御系统和非酶促防御系统就会发挥作用[2]。植物体内通过SOD、CAT和POD同工酶的相互协调配合，可清除过剩的自由基，使体内自由基维持正常的动态平衡，提高植物抗逆性。SOD的主要功能是特异性的催化超氧阴离子的歧化反应，对防止活性氧对机体的伤害及防御机体衰老有十分重要的作用[3]。在植物中存在Cu·Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三种。测定SOD的方法有NBT光化还原法、超氧化钾直接测定法、邻苯三酚自氧化法和黄嘌呤氧化酶法等[4]。

本试验采用黄嘌呤氧化酶法，对遭受棘梢斑螟[5]危害的樟子松球果中的SOD活性进行测定，以确定最佳测定条件。

1 试验材料

1.1 球果：采自内蒙古红花尔基林业局林场，按危害程度不同，分成4个等级，健康的为0级，表面有轻微取食痕迹的为1级，中度危害(表面能看到两个取食孔)为2级，重度危害(表面有3个或3个以上取食孔，球果表面产生变色现象)为3级。

1.2 试剂：磷酸二氢钾、氢氧化钠、冰醋酸、考马斯亮蓝G-250、95%乙醇、85% H3PO4、标准牛血清蛋白、氯化钠、双蒸水、碳酸钙、石英砂、SOD测试盒(南京建成)。

1.3 仪器设备：研钵、离心机、分析天平、电热恒温水浴锅、移液器、1cm光径比色皿、紫外分光光度仪。

2 试验方法

2.1 试验流程

2.1.1 相同危害等级的球果样品混在一起，准确称取樟子松球果2g，加入8mL 0.1mL/L pH=7.2的磷酸盐缓冲液，加少量碳酸钙和石英砂，冰浴下研磨成匀浆，制备成20%的匀浆液，3500～4000r/min离心10min，取上清液待测。

2.1.2 按下表加入试剂，应用液要现用现配。

表1 SOD活性测定流程 mL

混匀，室温放置10min后，于波长550nm处，1cm光径比色皿，用双蒸水调零，进行比色。

2.2 最佳取样量确定

由于酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，抑制率在15%～55%基本为正比关系，因此最佳取样量应控制在15%～55%，以45%左右为最佳。

抑制率R=(对照OD值—测定OD值)/对照OD值

2.3 显色时间对SOD活力的影响

有时由于实验量等因素的影响，导致不能及时测定样品的吸光度，故设计不同显色时间。在混匀后，分别于室温放置10、15、20min测定吸光度，用SPSS17.0软件进行差异显著性分析。

2.4 试验的可重复性

取10个健康球果样品进行3平行试验，计算变异系数。

2.5 总SOD活力计算

2.5.1 根据组织湿重进行换算

以每克组织在1mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。

注：R为抑制率；V1为反应液总体积(mL)；V2为取样量(mL);匀浆液浓度(g/mL)C1=(组织湿重(g))/(匀浆介质体积(mL))

2.5.2 根据蛋白浓度进行换算

蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法。以每毫克组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位(U)。

注：R为抑制率；V1为反应液总体积(mL)；V2为取样量(mL)；C2为待测样本蛋白浓度(mgprot/mL)；mgprot为毫克蛋白数。

3 试验结果

3.1 最佳取样量确定

表2 不同取样量下SOD抑制率

因此，取样量定为80μL。

3.2 显色时间对SOD活力的影响

显色10、15、20min所测OD值，进行单因素ANOVA分析，P值为0.859>0.05，差异不显著，因此显色时间对SOD活力影响不大。

3.3 可重复性

测定结果，吸光度OD=0.337±0.007，P值为0.336，样品间差异不显著；变异系数CV为(1.19±0.11)%，可见该方法可重复性良好。

3.4 用不同方法计算总SOD活力

3.4.1 组织湿重法

图1 组织湿重法SOD总活力趋势图

用组织湿重法表示总SOD活力，随危害等级的增加，总SOD活力呈现先上升后下降的趋势，危害等级为2级时总SOD活力最高，3级时虽有所下降但仍高于0级。显著性检验时，P值为0.000，说明不同危害等级的球果SOD活力差异极其显著。

3.4.2 用蛋白浓度表示总SOD活力

蛋白浓度标准曲线y=.0069x，R2=0.999

表3 不同危害等级的球果中蛋白浓度

图2 蛋白浓度法SOD总活力趋势图

用蛋白浓度法表示SOD总活力，结果与组织湿重法基本一致，可以排除蛋白质的存在对测定结果的干扰。显著性检验，P值为0.000，说明不同危害等级的球果SOD活力差异极其显著。

4 结论

樟子松是我国固沙造林地区重要的造林树种之一，具有耐瘠、耐旱、防风、固沙特点[6]。在遭受棘梢斑螟危害后，樟子松球果SOD活性发生显著变化。结果表明，随危害等级的增加，总SOD活力呈现先上升后下降的趋势，危害等级为2级时总SOD活力最高，为108.51U/mg prot，危害等级为3级时总SOD活力82.36 U/mg prot，虽有所下降但仍高于0级的74.74 U/mg prot，说明樟子松在逆境(虫害)条件下，发生明显的防御反应，来降低自身的损伤。采用黄嘌呤氧化酶法[7]测定樟子松球果总SOD活力，应用液与显色剂需现配现用，最佳取样量为80μl，此时SOD抑制率为46.5%，线性关系最佳，测定效果好，该方法显色稳定，可重复性强，适用于樟子松球果总SOD活力测定。研究结果可为树种抗性选优提供理论依据，在害虫综合治理中，利用植物本身的抗虫性是重要的策略[8]。

[1]喻方圆,徐锡增.植物逆境生理研究进展[J].世界林业研究, 2003, 16(5): 6-11.

[2]万东石,李红玉,周攻克,等.虫害对不同水分条件胡杨披针形叶活性氧代谢的影响[J].2004,15(5):849-852.

[3]陈鸿鹏,谭晓风.超氧化物歧化酶 (SOD) 研究综述[J].经济林研究, 2007, 25(1): 59-65.

[4]李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京:高等教育出版社, 2000.

[5]朴哲浩,孙玉芬,张永卫.樟子松种实害虫防治的初步探讨[J].内蒙古林业, 2004, 2: 25-26.

[6]康宏樟,朱教君,李智辉,等.沙地樟子松天然分布与引种栽培[J].生态学杂志,2004,23(5): 134-139.

[7]翁闪凡,张晓林.黄嘌呤氧化酶法优化大鼠血清SOD测定条件的探讨[J].佛山科学技术学院学报: 自然科学版, 2011, 29(3): 67-67.

[8]刘井兰,杨霞,吴进才.褐飞虱侵害对水稻叶片,根SOD活性及丙二醛含量的影响[J].应用昆虫学报, 2011, 48(5):1387-1393.