逄世峰，闫梅霞，孙成贺，王英平

(中国农业科学院特产研究所，长春130112)

蛹虫草(CordycpsmilitarisLink) 又名北冬虫夏草，属真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、麦角菌目、麦角菌科、虫草属，是冬虫夏草的近缘种[1]，是我国历史上十分名贵的珍稀、营养、滋补、保健及药用真菌[2-3]。

西洋参在我国有悠久的药用历史,具补虚,安神降压,益气生津,祛痰解热之功效[4]，现代药理学研究证实人参皂苷是其发挥药理作用的主要活性成分，其中以人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd含量最高[5]。

微生物发酵是利用微生物细胞产生的一种或多种酶将外源底物进行催化使其转变成结构相关的经济价值更高的产物[6]。本文首次利用蛹虫草固态发酵西洋参，研究蛹虫草固态发酵对西洋参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd的转化作用,为药用植物产品开发提供一种新途径。

1 仪器、试剂和材料

1.1 仪器

超高效液相色谱仪(waters公司)；电子分析天平(sartorius CPA225D 型)。

1.2 试剂

乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3 材料

蛹虫草(CordycepsmilitarisLink)；西洋参(PanaxquinquefoliumL.)须为干燥须根；人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd(购自中国药品生物制品检定所)。

2 方法与结果

2.1 培养基配制

复合PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，MgSO42g，K2HPO41.5g，KH2PO41.5g，琼脂18g，水1000mL。

液体菌种培养基(PDB)：不加琼脂的复合PDA培养基配方。

固体发酵培养基：取5年生干燥西洋参须，截为长度3～5cm，选用100mL三角瓶，每瓶装入5g西洋参须，料水比为1g∶2mL，121℃灭菌20min。

2.2 菌种复壮和液体菌种制作

试管种平板复壮：将4℃保存的试管种进行平板复壮(22℃，暗培养)，复壮培养基为复合PDA培养基。

液体菌种制作：用复壮后菌种制作液体菌种，培养基为液体菌种培养基(PDB)，选用250mL三角瓶，装液量为130mL/瓶，接种3块经打孔器打孔的平板菌种，摇床培养，180r/min，22℃暗培养7d。

2.3 固体发酵接种与培养

固体培养基每瓶接种4mL液体菌种，置于23℃黑暗培养，分别于第0、1、2、3、4、6、8、11、14、17、20、23、26、28、31、34、37d取样。

2.4 人参皂苷含量测定

2.4.1 对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd对照品1.00、1.22、1.00、0.97、1.74、1.02、1.54mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇适量使其溶解，稀释至刻度，摇匀即得。

2.4.2 色谱条件[7]

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×50 mm，1.7 μm)，流动相乙腈-水(梯度洗脱：0～3min，19%～19%乙腈；3～4min，19%～21%乙腈；4～5min，21%～26%乙腈；5～9min，26%～27%；9～12min，27%～32%乙腈；12～15min，32%～43%乙腈)，流速0.5 mL/min，检测波长为203 nm，柱温35℃，进样量2 μL。

图1 标准品和样品UPLC色谱图

2.4.3 标准曲线的绘制

取人参皂苷Rg1、Re、Rg1、Rb2、Rb3、Rc、Rd标准品溶液，加甲醇制成一系列浓度的混合标准品溶液，在上述色谱条件下，注入超高效液相色谱仪。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，回归方程如下：

Rg1:Y=9.86×105X-1.68×103(R2=0.9993)

Re:Y=1.21×106X +1.57×103(R2=0.9997)

Rg1:Y=6.56×105X-2.11×103(R2=0.9991)

Rc: Y=5.76×105X-1.83×103(R2=0.9996)

Rb2:Y=5.97×105X-2.79×103(R2=0.9996)

Rb3:Y=7.54×105X-1.46×103(R2=0.9990)

Rd:Y=6.61×105X +4.87×103(R2=0.9984)

2.4.4 样品含量测定

每个样品加入50mL甲醇静置提取3天，取上清液过0.22μm微孔滤膜后超高效液相色谱仪测定。在上述色谱条件下测定人参皂苷Rg1、Re、Rg1、Rb2、Rb3、Rc、Rd含量，结果见图2。

图2 蛹虫草固态发酵西洋参皂苷含量变化

由图2可知，在蛹虫草固态发酵西洋参基质过程中，本实验测定的7种人参皂苷Rg1、Re、Rg1、Rb2、Rb3、Rc、Rd含量均有不同程度的变化。总体来看，人参皂苷Rg1、Re、Rg1、Rb2、Rc、Rd在接菌后的24h内含量明显降低，Rb3含量升高；Rg1在第1～3天含量先升后降，4～20天含量逐渐降低，20～31天含量变化不大，31～37天含量降低；Rd含量1～26天逐渐升高，26～37天含量降低。

3 讨论

随培养时间延长，本实验测定的7种人参皂苷出现不同程度的变化，其中以人参皂苷Rg1和Rd变化最为明显，第26天人参皂苷Rd含量最高，与第0天相比较，Rd含量增加290.69%，Rg1转化率为84.59%，且Rg1减少量与Rd增加量相当，推断在酶的作用下，人参皂苷Rg1向Rd转化[8]。培养后期，菌丝长满基质后，各人参皂苷含量均有不同程度的降低，可见皂苷含量与菌丝生长状况密不可分。

总之，蛹虫草菌种所产生的酶系对人参皂苷具有转化作用，且专一性较好，此方法为人参皂苷Rd的大量制备提供了一种新资源，同时也为功能产品开发及新药生产提供了一种新途径。

[1]胡昭庚.17种药用真菌栽培[M].北京:中国农业出版社,1999.

[2]李昊,吴白昌,李春兰.虫草人工栽培与深度开发[M].北京: 科学技术文献出版社,2003:3-5.

[3]张平,朱述钧,钱大顺,等.北冬虫夏草功能成分及保健作用分析[J].江苏农业科学,2003(6): 105-107.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:化学工业出版社,2010:122.

[5]孟祥颖,任跃英,李向高,等.西洋参中皂苷类成分的研究综述[J].特产研究,2001(3):43-46.

[6]孙亮,张美萍,王义,等.人参皂苷生物转化及固体发酵工艺研究进展[J].食品工业科技,2013,32(15):395-399.

[7]张翠英,董,梁,陈士林，等.人参药材皂苷类成分UPLC特征图谱的质量评价方法[J].药学学报,2010,45 (10):1296-1300.

[8]Li Ye,Chao-Qun Zhou,Wei Zhou,et al.Biotransformation of ginsenoside Rg1to ginsenoside Rd by highly substrate-tolerant Paecilomyces bainier 229-7[J].Bioresource Technology,2010,101: 7872-7876.