黎 萍 于文畅 郑百红 李君瑶 张 捷

(吉林大学第二医院儿科， 吉林 长春 130041)

非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的75%～80%，其中70%以上的NSCLC确诊时为中晚期〔1，2〕。以铂类为基础的联合化疗在其综合治疗中占有重要地位，但铂类的耐药严重地影响了其临床疗效〔3〕。多种天然植物具有抗癌作用，且副作用较小〔4〕。红景天提取自中草药红景天根，具有广泛的药理作用〔5〕。研究证实，红景天能抑制肝癌、肺癌等肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡〔6, 7〕。顺铂是铂类药物中最经典、最具代表性的药物；凋亡耐受是肿瘤细胞对顺铂产生耐药的主要机制之一〔8〕，红景天能否通过诱导肺癌细胞的凋亡，协同顺铂对肺腺癌耐药细胞的发挥生长抑制、凋亡诱导的作用，从而增强肺腺癌耐药细胞对顺铂的敏感性？目前未见相关报道。本研究拟观察红景天联合顺铂对人肺腺癌A549/DDP耐顺铂细胞株的作用。

1 材料与方法

1.1细胞及主要材料 人肺腺癌细胞株A549及其耐顺铂细胞株A549/DDP购自中国医学科学院肿瘤医院，两个细胞株均在RPMI1640培养液(含10%新生牛血清)中，37℃、5% CO2的孵箱内培养。A549/DDP在1 μg/ml顺铂培养液培养7 d以上以维持耐药性。MTT、顺铂、胰酶、RPMI1640培养基均购自碧云天生物科技有限公司；caspase3、聚腺苷二磷酸-核糖(PARP)抗体一抗购自Santa-cruz公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自武汉博士德公司。

1.2MTT法检测红景天、顺铂对A549/DDP细胞的生长抑制 将A549/DDP细胞以1×104个/孔接种于96孔板，每个浓度设4个复孔。红景天组细胞加入0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mg/ml梯度浓度的红景天，顺铂组加入80、40、20、10、5、2.5、1.25 μg/ml浓度梯度顺铂，继续培养24 h。每孔加入MTT溶液，37℃继续培养4 h，小心吸弃孔内培养上清，每孔加入150 μl的DMSO振荡10 min溶解结晶，用酶标仪测吸光度(OD570 nm)值，细胞的生长抑制率的数值(%)=(1-实验组/对照组)×100%。

1.3流式细胞术检测细胞的凋亡率 调整细胞浓度为0.5×106接种于培养皿中，设对照组、红景天组、顺铂组及红景天+顺铂组，根据细胞生长抑制率，取适宜浓度的红景天、顺铂作用于A549/DDP细胞24、48、72 h后，收集细胞，Annxni-V和PI染色后，1 h内流式细胞仪检测凋亡细胞。

1.4Western印迹法检测凋亡相关蛋白的表达 提取各组细胞的总蛋白，行蛋白定量后，取40 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转，封闭，加入人酶切caspase3、酶切PARP一抗杂交，再加入二抗，按ECL试剂盒说明书发光、曝光。以β-actin为内参照，以目的蛋白的相对光密度值间接表示蛋白含量。所有实验至少重复3次。用1.8 mg/ml红景天作用于A549/DDP细胞12、24、48 h，用Annexin-V和PI进行染色后，用流式细胞仪分析凋亡细胞。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0统计软件包，采用线性回归计算红景天及顺铂作用于A549/DDP细胞的IC50。两组间比较采用t检验；采用One-Way ANOVA分析多组间比较，采用LSD法行组间两两比较。

2 结 果

2.1A549/DDP对顺铂耐药性 顺铂作用A549/DDP 24 h的 IC50为(36.41±4.14)μg/ml，而A549细胞的IC50为(7.98±1.23)μg/ml，和A549细胞比，等量的顺铂对A549/DDP抑制作用有限，该结果表明A549/DDP对顺铂明显耐药。

2.2联合应用红景天及顺铂对A549/DDP细胞的抑制率 红景天、顺铂对A549/DDP细胞均有生长抑制作用，并呈浓度依赖性。见表1和表2。红景天对A549/DDP细胞作用24 h的IC50为(1.91±0.32)mg/ml，48 h的IC50为(1.24±0.27)mg/ml。6.0 μg/ml顺铂、1.8 mg/ml红景天和二者联合作用于A549/DDP细胞，24 h后抑制率分别为：(24.88±3.72)%、(24.69±1.73)%及(54.6+2.95)%，红景天+顺铂组与另外两组差异显著(F=69.63，P<0.001)。

表1 顺铂对人肺腺癌细胞抑制率的影响±s,n=3,%)

表2 不同浓度红景天24、48 h对A549/DDP细胞抑制率的影响±s,n=3,%)

2.3联合应用红景天及顺铂对A549/DDP细胞凋亡率的影响 药物作用24 h后，顺铂组细胞凋亡率明显高于空白对照组(P<0.05)；红景天组细胞凋亡率均明显低于联合用药组(P<0.05)。见表3。

2.4联合应用红景天及顺铂对A549/DDP细胞凋亡相关蛋白表达的影响 各组细胞蛋白电泳结果显示，凋亡相关蛋白酶切caspase 3以及酶切PARP表达明显增加，见图1。

表3 各组A549/DDP细胞的凋亡率±s，n=3,%)

图1 各组细胞凋亡相关蛋白电泳图

3 讨 论

红景天为多年生草本或亚灌木野生植物，药理学研究表明其主要药理活性成分为红景天苷〔5〕。红景天对肿瘤的抑制作用国内外均有报道〔7, 9〕。红景天在体外对人肝癌HepG2细胞具有显著的抑制作用〔6〕；本研究显示，红景天可明显增强顺铂对人肺腺癌耐药细胞A549/DDP的生长抑制与凋亡促进作用。

顺铂通过多种机制发挥抗癌作用，目前已经明确的最重要的机制是顺铂通过引起肿瘤细胞DNA损伤，并激活凋亡信号发挥作用。本研究表明，A549/DDP对顺铂具有一定耐药性，联合应用红景天、顺铂对A549/DDP 细胞的凋亡促进作用明显增强。已有报道表明，红景天可能通过干扰细胞代谢、改变细胞外衣的性质抑制肺腺癌细胞体外生长〔10〕。本研究中，红景天能抑制肺腺癌耐药细胞的生长，红景天对A549/DDP的抑制作用呈时间依赖性、浓度依赖性。1.8 mg/ml红景天可以显著增强顺铂诱导A549/DDP细胞的凋亡发生，且作用呈时间依赖性。凋亡执行蛋白caspase3以及其作用底物聚(ADP-核糖)PARP分别通过裂解成酶切caspase3及酶切PARP发挥凋亡执行功能。另有研究表明，红景天可能通过增强机体的抗肿瘤免疫应答，抑制Lewis肺癌小鼠移植瘤的生长〔11〕。

综上，红景天与顺铂有协同作用，二者联合对多药耐药肺癌细胞的增殖抑制、凋亡促进的作用显著加强；红景天能增强肺癌抗肿瘤免疫应答〔11〕。

4 参考文献

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