李跃军 卓德斌

(湖南中医药高等专科学校第一附属医院肿瘤科，湖南 株洲 412000)

胃癌是我国高发病率、高死亡率的恶性肿瘤。5-氟尿嘧啶(5-Fu)是临床治疗胃癌常用的化疗药物，但有效率低，容易产生耐药性，如何克服其耐药是目前胃癌治疗的难点。肿瘤细胞高表达ABC转运蛋白家族(乳腺癌耐药蛋白ABCG2、P-糖蛋白MDR1)使肿瘤具有原发性多药耐药性，使肿瘤细胞能逃离多种化疗药物的毒性和杀伤作用。本实验通过体外观察5-Fu耐药的CD44+ SGC-7901/5-Fu细胞株ABCG2、MDR1基因表达水平，初步探讨其获得性耐药机制。

1 材料和方法

1.1细胞株及主要试剂 胃癌细胞株(SGC-7901)购自中科院上海生物研究；5-Fu(Sigma，美国)；鼠抗人CD44抗体(Biolegend，美国)；MTT(Sigma，美国)；胰蛋白酶 (Amreseo，美国)；新生牛血清(Sigma，美国)。RPMI-1640 (Gibco，美国)。AnnexinⅤ-FITC 凋亡检测试剂盒(北京宝赛公司)。

1.2实验设备 生物安全柜(THERMO，美国)；CO2培养箱(德国)；倒置显微镜 (OLYMPUS，日本)；酶标仪(Biorad，美国)；FACSAria流式细胞仪(Biolegend，美国)。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养 用含10%灭活小牛血清(FBS)和青、链霉素(100 U/ml)的RPMI-1640培养液体外培养SGC-7901。37℃、5%CO2，根据细胞生长情况，每1～2 d换液。

1.3.25-Fu耐药的SGC-7901/5-Fu胃癌细胞模型建立 采用反复大剂量冲击结合逐步递增药物浓度法，取对数生长期的SGC7901细胞，加入5 mg/L 5-Fu，于37e、5% CO2、全湿度培养箱内孵育24 h，用不含Ca2+、P3-的磷酸盐缓冲液 D-Hanks洗1次，将细胞培养于无药RPMI-1640完全培养液中，待细胞恢复生长后(7～10 d)，反复用5-Fu冲击处理，同时逐渐增加药物浓度(5、10、15、20、25、35、40)，经过8次冲击至5-Fu药物浓度达40 mg/L，建立其耐药细胞株 SGC7901/5-Fu。待细胞恢复生长后将其维持培养于含5-Fu 10 mg/L的RPMI-1640完全培养液中，每 2～3 d传代1次。撤药2 w后进行细胞实验。

1.3.3流式细胞仪检测分选CD44+SGC-7901/5-Fu细胞 取对数生长期SGC-7901/5-Fu细胞，胰酶消化后用10%FBS DMEM/F12终止消化，2 500 r/min离心5 min后弃上清。……