王树东 丁丽娟 王 倩 李 特 刘 全

(吉林大学第一医院,吉林 长春 130012)

急性心肌梗死(AMI)后心肌细胞凋亡，左心室心肌细胞凋亡后心室重构使AMI患者左心室功能严重受损，死亡率明显增加〔1〕。Bcl-2/Bax是参与凋亡的重要基因家族之一，Bcl-2/Bax比例失衡即Bax相对过表达在AMI的病变中起重要作用〔2〕。研究证实银丹心脑通软胶囊能够改善脑缺血〔3〕，缓解心肌缺血，增加冠脉血流量，扩张狭窄的冠脉及改善冠脉侧支循环，治疗AMI具有很好的作用〔4，5〕。针对AMI的动物研究显示，银丹心脑通软胶囊可抑制梗死后心肌细胞凋亡〔6〕，但具体机制尚无报道。本实验通过观察银丹心脑通软胶囊对AMI后大鼠心肌Bcl-2、Bax表达的影响探讨其防治AMI后心肌细胞凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂 银丹心脑通软胶囊(贵州百灵企业集团制药有限公司)，卡托普利(上海施贵宝公司)，TUNEL试剂盒(德国宝灵曼公司)，TRIZOL(invitrogen)，M-MLV 逆转录酶、DNA Marker(Takara)，dNTP、(oligo)dT(上海生工生物工程技术服务有限公司)，其他试剂为国产分析纯。

1.2梗死动物模型建立及分组 90只Wistar大鼠雌雄各半，结扎冠脉前降支建立AMI模型。术后24 h存活大鼠随机分为，模型组、银丹心脑通大剂量组(1.6 g·kg-1·d-1)、银丹心脑通小剂量组(0.8 g·kg-1·d-1)、阳性药对照卡托普利组(5 mg·kg-1·d-1)各12只，假手术组(只穿线不结扎)10只。各给药组均灌胃1次/d，共4 w，模型组与假手术组给予同等剂量生理盐水作为对照。

1.3AMI范围测定 动物心脏称重，将左心室心肌横切4～5 片，然后浸入N-BT 磷酸缓冲液中，置37℃恒温水浴，待染色完全后取出，正常组织染色，缺血组织不染色。照相后图像软件分析，用缺血心肌占左心室心肌面积的百分比计算MIS。

1.4RT-PCR 检测Bcl-2/Bax mRNA表达 取冻存的左心室心肌组织，采用TRIZOL一步法常规提取总RNA。Bcl-2、Bax及 GAPDH PCR引物由 Takara 合成，PCR产物大小分别为427、469、700 bp，GI22010型全自动凝胶成像系统(Tanon,中国)成像并比较Bcl-2、Bax mRNA与GAPDH mRNA 的相对表达量。

1.5脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)染色 取病变部位的心肌常规脱水固定，石蜡包埋、切片，宝灵曼公司试剂盒(POD) 提供的TUNEL原位检测凋亡细胞的DNA碎片。以单位面积内凋亡细胞数为计算凋亡指数(AI)。

2 结 果

2.1左室梗死范围 模型组大鼠左室梗死范围明显高于假手术组(P<0.05)；银丹心脑通软胶囊的大、小剂量组及卡托普利组较模型组明显减小(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠左室截面直径及梗死范围比较

2.2心肌细胞AI 与假手术组(1.25±0.87)相比，梗死模型组左心室非梗死区的心肌细胞AI(23.33±3.87)显著增加(P<0.05)。银丹心脑通软胶囊大、小剂量组(9.33±1.37；12.58±2.07)和卡托普利组AI(11.17±2.66)明显低于模型组(P<0.05)。

2.3RT-PCR检测Bcl-2/Bax mRNA表达情况 与模型组比较，各给药组Bcl-2 mRNA表达增加(P<0.05)，以银丹大剂量组最明显，小剂量与卡托普利组间无明显区别。

大鼠AMI 4 w后，假手术组心肌Bax mRNA仅有少量表达，模型组较假手术组表达明显增多(P<0.01)。与模型组比较，各给药组Bax mRNA表达减少(P<0.05)，以银丹大剂量组最明显，小剂量与卡托普利组无明显区别。见图1。

1：假手术组；2：模型组；3：银丹心脑通大剂量组；4：银丹心脑通小剂量组；5：卡托普利组

3 讨 论

银丹心脑通软胶囊主要成分为银杏叶、丹参、灯盏细辛、三七、大蒜、绞股蓝、山楂、冰片，其单味药的基础和临床研究已取得了重大进展，大部分单味药已经精制成静脉注射剂广泛使用，疗效也得到了国内外的认可。银丹心脑通软胶囊兼顾了对冠心病重要危险因子的调理，急缓兼顾，长期应用对控制患者病程进展、预防冠心病事件发生具有重要意义。

Bcl-2和Bax 是一对凋亡调节蛋白，参与细胞凋亡线粒体途径的调节。Bcl-2主要位于线粒体膜、核膜和内质网膜，具有抗细胞凋亡作用。Bax定位于细胞质中，可在凋亡诱导因素作用下发生构型变化，从细胞质移位到线粒体膜，与Bcl-2形成异源二聚体抑制Bcl-2的活性，增加线粒体膜的通透性，使线粒体膜上通透性转换孔开放，导致细胞色素C、(Cyt C)凋亡诱导因子等释放到细胞质中。释放到细胞质中的Cyt C 与胞质中的凋亡蛋白酶激活因子-1和Caspase-9酶原结合形成凋亡酶体，生成有活性的Caspase-9，触发凋亡蛋白酶的级联反应引起细胞凋亡的发生。Bax自身也可形成同源二聚体，同源二聚体Bax/Bax的比例大于异源二聚体Bcl-2/Bax时，会促进心肌细胞的凋亡，反之会抑制细胞凋亡。Li等〔7〕认为由于心脏收缩时坏死心肌向外膨出，反常被动张力的产生使坏死心肌承受更大的壁应力，导致细胞内钙水平明显增加，完整的线粒体膜遭到破坏，线粒体通透性孔开放，导致凋亡〔8〕。本实验提示银丹心脑通软胶囊可能通过抑制Bax的表达，减少心肌细胞凋亡。

4 参考文献

1Rosenkranz S.TGF-β1 and angiotensin networking in cardiac remodeling〔J〕.Cardiol Res，2004；63(3):423-32.

2Misao J，Hayakawa Y，Ohno M,etal.Expression of Bcl-2 protein，an inhibitor of apoptosis，and Bax，an accelerator of apoptosis，in ventricular myocytes of human hearts with myocardial infarction〔J〕.Circulation，1996；94(7):1506-12.

3卫 国,阮波群.银丹心脑通软胶囊治疗急性脑梗死患者80例〔J〕. 中西医结合心脑血管病杂志,2013；11(3)：326-7.

4黄 炯.银丹心脑通软胶囊治疗冠心病心绞痛的临床研究〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志,2007；6(5)：385-7.

5骆 琼,马 丽,叶瑞林,等.银丹心脑通软胶囊治疗慢性稳定型心绞痛临床观察〔J〕.上海中医药杂志,2013；47(1)：44-6.

6盖玉生,左鲁宁,乔卫卫,等.银丹心脑通软胶囊抑制大鼠急性心肌梗死后心肌细胞凋亡〔J〕.上海中医药杂志,2013；47(1)：55-7.

7Li Y，Takemura G，Kosai K,etal.Critical roles for the Fas/Fas ligand system in postinfarction ventricular remodeling and heart failure〔J〕.Cir Res，2004;95(6)：627-36.

8Oskarsson HJ,Coppey L, Weiss RM,etal.Antioxidants attenuate myocyte apoptosis in the remote non-infarcted myocardium following large myocardial infarction〔J〕.Cardiovas Res，2002;45(3):679-87.