李 健 钟美蓉 宋成军 王小杰 陈志宏

(承德市中心医院耳鼻喉科，河北 承德 067000)

糖尿病截肢患者几乎都存在周围神经病变，病程20年的糖尿病患者，神经病变的发病率约为60%，且随病程延长有逐渐增加的趋势〔1〕。当前，多以控制血糖并辅助营养神经及活血化瘀等药物治疗糖尿病周围神经病变。在临床上多用西药控制血糖，但西药的不良反应不容忽视。前期研究发现，丝胶(彩色蚕茧水提取物)可明显降低血糖和调节血脂代谢紊乱，保护糖尿病胰岛细胞损伤和性腺功能障碍〔2～4〕。本研究观察糖尿病模型大鼠坐骨神经神经微丝蛋白(NFP)表达的变化，探讨丝胶对2型糖尿病周围神经损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1药物与试剂 链脲佐菌素(STZ)，美国Sigma公司；小鼠抗NFP多克隆抗体，美国Santa Cruz公司，购自武汉博士德生物工程有限公司。丝胶为彩色蚕茧经浸泡、水煎、过滤、浓缩而成，彩色蚕茧由承德医学院蚕业研究所提供。

1.2实验动物及分组 3月龄清洁级雄性SD大鼠36只，体重200～250 g(合格证号：712024)，由河北医科大学实验动物中心提供。随机选取12只为正常对照组，常规饲养，腹腔注射同等剂量STZ溶剂(PH 4.4的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液)3次(1次/d)；其余的24只大鼠小剂量STZ连续腹腔注射(2% STZ，25 mg/kg，3 d)建立2型糖尿病动物模型，7d后以空腹血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准〔5〕；然后再随机分为糖尿病模型组和丝胶治疗组，丝胶治疗组大鼠给予丝胶(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃35 d，正常对照组、模型组大鼠灌胃给予同等剂量的生理盐水35 d。

1.3检测血糖 各组大鼠用药结束后4%水合氯醛腹腔注射麻醉，眶后静脉丛采血，3 000 r/min离心20 min后取血清，应用全自动临床生化分析仪采用葡萄糖氧化酶法检测血糖。

1.4检测坐骨神经NFP的表达 大鼠取血后断头处死，于膝关节上方取长约4 cm的坐骨神经干，入Bouins液固定，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm。SP免疫组织化学染色检测坐骨神经NFP的表达。小鼠抗NFP一抗稀释浓度1∶50，DAB显色，苏木素复染细胞核，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，以坐骨神经轴索中出现棕黄色颗粒为NFP阳性反应。采用MiVnt图像分析系统进行定量分析：每张切片于10×20倍显微镜下选取3个视野，计算免疫阳性产物面积占视野面积的比值，每只大鼠选取6张切片，每组随机选取6只大鼠，取平均值作为NFP的相对表达水平。

1.5统计学方法 应用SPSS15.0统计学软件，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。

2 结 果

2.1各组大鼠的血糖表达 糖尿病模型大鼠的血糖明显高于正常对照组大鼠(P<0.01)；丝胶治疗组大鼠的血糖明显高于糖尿病模型大鼠(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠的血糖和坐骨神经NFP的表达

2.2各组大鼠坐骨神经NFP的表达 NFP免疫阳性产物为棕黄色，位于坐骨神经的轴索。与正常对照组大鼠比较，糖尿病模型组大鼠坐骨神经NFP的表达明显降低(P<0.01)；丝胶治疗组大鼠坐骨神经NFP的表达明显高于糖尿病模型组大鼠(P<0.05)。见图1。

图1 各组大鼠坐骨神经NFP的表达(免疫组化染色，×200)

3 讨 论

糖尿病属中国传统医学“消渴症”范畴，糖尿病周围神经病变在糖尿病的基础上发展而来，以脏腑阴虚燥热、气阴两虚、津液疏布失常为基础，随着病程的延长，日久导致癖血阻滞经络，出现肢体疼痛、麻木等诸多表现。蚕茧，蚕蛾科昆虫家蚕蛾的茧壳，性甘、温，无毒，具有滋阴润燥、生精止渴作用，主治多饮、不生肌肉、肾消白浊和上中二消。

糖是机体重要的能量来源之一，正常稳态的血糖可保证能量代谢的需要，血糖过高会引起一系列的病理生理变化。大量研究已经证实，高血糖不但可导致糖尿病，还会降低机体对胰岛素的敏感性〔6〕。研究表明，长期血糖控制不佳与糖尿病周围神经病变的发生密切相关；而有效控制血糖，可以预防、延缓糖尿病周围神经病变的发生与进展〔1，7〕。

NFP是神经元细胞骨架的主要组成部分，是反应神经元和突触功能状况的内在标志物之一，在维持神经细胞正常形态和轴浆运输方面具有至关重要的作用。细胞骨架是细胞质内的非膜性细胞器，由微管、微丝和中间丝等组成，神经元中的中间丝主要为NFP。NFP除形成细胞骨架起支持作用外，还有研究发现，细胞内98%有活性的多聚核糖体与NFP有关。以细胞松弛素D处理细胞，可使多聚核糖体脱落，同时蛋白质合成停止，说明NFP与DNA的转录和翻译有关，并参与轴浆运输〔8〕。轴浆运输不仅为神经元的新陈代谢提供物质基础，还参与神经系统中的分子信息传递以及物质交换，对神经元正常结构和功能的维持具有重要意义〔9〕。研究表明，糖尿病时存在明显的骨架蛋白基因的改变〔10〕。Scott等〔10〕的研究发现，糖尿病时NFP的表达可下降26%～46%，并伴有有髓神经纤维和无髓神经纤维中NFP阳性纤维及微管数量和密度的下降，以及无髓神经纤维的萎缩。NFP表达的减少可导致神经元的物质合成、迁移和细胞内物质转运过程出现障碍，致使神经系统的功能活动无法正常维持。

4 参考文献

1Callaghan BC,Little AA,Feldman EL,etal.Enhanced glucose control for preventing and treating diabetic neuropathy 〔J〕.Cochrane Database Syst Rev,2012;6: CD007543.

2付秀美，钟美蓉，陈志宏，等.丝胶对2型糖尿病大鼠血糖和血脂的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(1)：103-5.

3宋成军，付文亮，陈志宏.丝胶预处理对2型糖尿病大鼠睾丸生殖细胞的保护作用〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(13)：2459-61.

4付秀美，马洪伟，陈志宏，等.丝胶对Ⅱ型糖尿病大鼠胰岛细胞的保护作用〔J〕.解剖学杂志，2010；33(2)：161-4.

5向雪松，王 竹，祝宇铭，等.链脲佐菌素注射剂量对建立2型糖尿病大鼠模型的影响〔J〕. 卫生研究，2010；39(2)：138-42.

6Biarnes M,Montolio M,Nacher V,etal.Beta-cell death and mass in syngeneically transplanted islets exposed to short- and long-term hyperglycemia〔J〕.Diabetes,2002;51(1):66-72.

7Fujita Y,Fukushima M,Suzuki H,etal.Short-term intensive glycemic control improves vibratory sensation in type 2 diabetes 〔J〕.Diabetes Res Clin Pract,2008;80(1):e16-9.

8Ackerley S,James PA,Kalli A,etal.A mutation in the small heat-shock protein HSPB1 leading to distal hereditary motor neuronopathy disrupts neurofilament assembly and the axonal transport of specific cellular cargoes 〔J〕.Hum Mol Genet,2006;15(2):347-54.

9Zochodne DW,Sun HS,Cheng C,etal.Accelerated diabetic neuropathy in axons without neurofilaments 〔J〕.Brain,2004;127(Pt 10):2193-200.

10Scott JN,Clark AW,Zochodne DW.Neurofilament and tubulin gene expression in progressive experimental diabetes: failure of synthesis and export by sensory neurons〔J〕.Brain,1999;122(Pt11) :2109-18.