刘金霞 郭争荣 孙殿兴 吴松柏

(承德医学院,河北 承德 050098)

细胞外基质沉积和降解失去平衡是肝细胞损伤后导致肝纤维化的主要原因。目前，临床上还缺乏确切有效的逆转肝纤维化药物，以冬虫夏草、丹参和复方 861 合剂、鳖甲软肝片等具有活血化瘀、软坚散节功效的单方或复方中药制剂具有比较好的抗肝纤维化疗效。中药组方能够多环节、多层次及多靶点的综合作用，具有广阔的抗纤维化开发和应用前景。本研究通过建立硫代乙酰胺诱导的小鼠肝硬化模型，采取不同时间和不同剂量分别观察软肝升白颗粒对层粘连蛋白(LN)、透明质酸(HA)含量的影响，以及肝组织中肝细胞生长因子(HGF)及其受体c-Met mRNA的表达水平，旨在探讨软肝升白颗粒抗纤维化的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1材料 软肝升白颗粒由白求恩国际和平医院制剂科配制，复方鳖甲软肝片由解放军302医院研制，内蒙古集宁制药厂馈赠，生产批号20060609；硫代乙酰胺(TAA)购买于Sigma公司； HA、LN检测试剂盒购自上海海军医学研究所；清洁级Wistar雄性小鼠100只，体重(18±20)g，由河北医科大学动物实验中心提供。

1.2造模和分组给药 TAA用精确度为1/万的电子天平称取并用饮用水稀释，采用TAA诱导法制备小鼠肝纤维化模型。20只为正常组(E组)，用饮用水喂养，其余均用0.03%TAA诱导饲喂〔1〕，每1～2 d更换1次饮用水，诱导时间20 w。造模成功后随机分为四组，每组20只， A组小鼠给予软肝升白颗粒8 g·kg-1·d-1(相当于成人剂量7倍)灌胃，B组给予4 g·kg-1·d-1(相当于成人剂量3.5倍)灌胃，C组小鼠给予鳖甲软肝片0.8 g·kg-1·d-1(相当于成人剂量的7倍)灌胃，D组(模型对照组)和E组分别给予等体积的生理盐水灌胃，造模结束后，停用TAA 1 w后，给予上述药物治疗，1次/d〔2〕。

1.3标本留取和指标检测 分别在治疗后第4、8周处死小鼠，腹主动脉取血，分离血清，由我院检验科全自动生化分析仪检测肝功能，应用放射免疫法检测小鼠血清HA、LN等肝纤维化指标，尽可能无菌条件下取部分肝组织，0.5×0.5×0.5 cm3，迅速液氮冷冻保存。TRIZOL试剂提取肝组织总RNA，合成cDNA第一条链，进行PCR扩增，严格按RT-PCR试剂盒说明书操作〔3〕。HGF正向引物5′TCAAATGCCAGCCTTGGAATTCC-3′，反向引物5′TCAAGAGTGTAGCACCATGGC-3′，片段385 bp，退火52℃，循环数32；C-met正向引物5′AGCTGTACCTTGACCTTAAGC3′，反向引物5′TTCAGGGTCTTCCCAATACC-3′,片段479 bp，退火54℃，循环数30；GAPDH正向引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，反向引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，片段651 bp,退火54℃,循环数33。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统进行照相，并进行半定量分析，以目的基因条带光密度值与内参照GAPDH条带光密度值比，表示目的基因相对表达量。

1.4统计学方法 应用SAS8.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1软肝开自颗粒治疗小鼠肝纤维化不同时间肝功能水平 谷丙转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)和总胆红素(TBil)见表1。

2.2血清HA、LN的变化 HA、LN与肝组织学变化呈正相关。与E组相比，D组HA、LN均升高(P<0.05)，与D组相比，治疗4 w，A、B、C组HA、LN均有所下降，但无统计学差异(P>0.05)。治疗8 w，A、B、C组HA、LN均有明显下降(P<0.05)，而A组HA、LN水平下降较B和C组明显(P<0.05)。见表2。

表1 软肝升白颗粒治疗小鼠肝纤维化不同时间肝功能水平

表2 软肝升白颗粒治疗小鼠肝纤维化不同时间血清

2.4HGF/c-Met系统在各组肝组织中的表达水平 图1可见，治疗4 w时，HGF/c-Met的表达水平在A组明显高于其他各治疗组和E组(P<0.05)，但B组与C组比较差异无统计学差异(P>0.05)，D组与E组比较有统计学差异(P<0.05)。治疗8 w时，随着肝损伤的好转，HGF/c-Met的表达水平有所下降，但在软肝升白颗粒A组HGF/c-Met的表达水平高于B、D、E其他各组(P<0.05)。

图1 HGF/c-Met系统在各组肝组织中的表达

3 讨 论

肝纤维化属于中医学“瘤”、“痹”、“痞”、“积”等范畴。由于痰瘀互结，全身气、血、津液运行不畅，阴阳失调，最终形成肝纤维化。软肝升白颗粒由黄芪、丹参、当归、桃仁、白术、党参、栀子、茵陈等16味中药组成，具有活血软坚、化痰除湿功效。尤其是丹参和黄芪，属于活血化瘀和补中益气类中药，在临床以及实验研究中都被证实有较明确的抗肝纤维化作用，有研究〔4〕认为与其下调炎性细胞因子、阻断肝脏库普弗细胞和肝星状细胞(HSC)活化、减少胶原组织的合成及促进自由基清除和抗脂质过氧化作用有关。本研究通过应用软肝升白颗粒治疗小鼠肝纤维化模型，发现小鼠肝功能、肝纤维化指标明显好转，检测HGF/c-MetmRNA水平，进一步证实通过HGF/c-MetmRNA高表达，HGF能够刺激肝细胞再生，抑制受损肝细胞凋亡的活性物质，具有抗肝损伤和抗肝纤维化作用〔5〕。其受体是c-Met原癌基因编码的一种跨膜酪氨酸激酶，HGF与其结合，引起酪氨酸激酶活化，激活细胞内多个信号级联反应，包括磷脂酰肌醇-3(PI-3K)、Grb/sos/Ras复合物、Gab-1、Shp-2、磷脂酶C、Ras-GTP酶活性蛋白和c-Scr等，从而使HGF/c-Met信号转导通路处于激活状态，并进一步调控DNA的合成、细胞周期运转过程中起重要作用的相关基因的表达，最终使细胞进入增殖期而发挥作用〔6〕。已知在四氯化碳(CCl4)所致小鼠肝纤维化模型中HGF组能够促进茎质金属蛋白酶(MMP)-13表达的同时，抑制MMP抑制剂(TIMP)-1的表达，MMP-13可与TIMP-1以1∶1非共价结合使其降解胶原活性受抑制〔6〕。因此，软肝升白颗粒能够通过提高HGF及其受体c-Met mRNA的表达，经过上述多种信号级联反应，改善肝功能的同时，降解细胞外基质，促进肝细胞再生，逆转肝纤维化〔7〕。

4 参考文献

1张 杰,陈积圣,王 坤,等.硫代乙酰胺诱导肝硬化模型方法的改进〔J〕.中华实验外科杂志,1999;16(6): 567.

2章元沛.药理学实验〔M〕.北京:人民卫生出版社,2000:238.

3Okuyama H,Nakamura H,Shimahara Y,etal. Overexpression of thioredoxin prevents thioacetamide-induced hepatic fibrosis in mice〔J〕.J Hepatol,2005;42:117-23.

4Liu Y.Hepatocyte growth factor in kidney fibrosis：therapeuitc potential and mechanisms of action 〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2010;287(1) :F7-16.

5Matsumoto K,Nakamura T.Hepatocyte growth factor：renotroptic role and potential therapeuics for renal diseases〔J〕.Kidney Int,2009;59(6) :2023-38.

6Watanalbe T,Niioka M,Hozawa S,etal. Gene expression of interstitial collagenase in both progressive and recovery phase of rat liver fibrosis induced by carbon tetrachloride〔J〕.J Hepatol,2000;33(2):224-35.

7Kim WH,Matsmoto K,Bessho K,etal.Growth inhibition and apoptosis in liver myofibroblasts promoted by hepatocyte growth factor leads to resolution from liver cirrhosis〔J〕. Am J Pathol,2005;166(14) :1017-28.