张笑男,杨伯涵,赵外欧， 王静媛

(1. 吉林大学 白求恩第一医院甲状腺外科,长春 130021;2. 吉林大学 化学学院,麦克德尔米德实验室,长春 130012)

两亲梳状聚衣康酸的合成及其阿霉素的缓释体系

张笑男1,杨伯涵2,赵外欧1， 王静媛2

(1. 吉林大学 白求恩第一医院甲状腺外科,长春 130021;
2. 吉林大学 化学学院,麦克德尔米德实验室,长春 130012)

采用自由基聚合法合成聚衣康酸(PIA),并将PIA接枝十二胺合成两亲性梳状聚合物(PIA-g-DDA). 利用动态光散射(DLS)测试PIA-g-DDA的溶液性质,并研究其流体力学直径和烷基链接枝比率对粒径大小的影响. 以芘为分子探针,通过荧光光谱法测定PIA-g-DDA的临界胶束浓度(CMC); 利用两亲性梳状聚合物PIA-g-DDA包埋阿霉素(DOX),通过相转移的方法制备聚合物载药体系PIA-g-DDA@DOX. 结果表明： 烷基链接枝率越高,聚合物的胶束粒径越小； 其CMC=2.01×10-2mg/mL; 该载药体系包埋率高,载药量大,缓释作用明显.

两亲性聚合物; 聚衣康酸; 药物控释; 阿霉素

两亲聚合物具有独特的物理性质,在控制释放、 生物分离、 稳定分散剂和流变改性剂等方面应用广泛[1-2]. 梳状两亲聚合物作为一种新型的药物载体,具有较高的内核载药容量和独特的体内分布特征. 聚合物在结构上具有亲水部分和疏水部分,在水溶液中能形成具有球形内核-外壳结构的共聚物胶束,其疏水部分构成内核,亲水部分形成外壳. 作为疏水性物质容器的内核可将疏水性药物等包裹在内部,降低其毒副作用,外壳可对药物起保护作用,提高药物的稳定性,并达到缓释作用[3]. 此外,纳米载药技术使原来因为毒副作用强、 口服活性低、 注射半衰期短或体内容易失活等因素而不能使用的药物重新得到使用,从而扩展了新药的开发领域[4-7].

阿霉素(doxorubicin)或盐酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride,DOX)是一种抗肿瘤抗生素,属周期非特异性药物,对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用,但对正常细胞也具有杀灭作用,毒副作用较强[8]. 利用梳状两亲共聚物包埋阿霉素制备药物缓释纳米粒子可提高药物的稳定性,降低药物毒副作用,并缓释或控释药物[9-10].

本文利用自由基聚合法合成生物可降解[11]的聚衣康酸(PIA). 通过酰胺化反应将部分PIA的羧基上连接十二胺,合成了两亲聚合物聚衣康酸接枝十二胺(PIA-g-DDA). 以PIA-g-DDA为相转移剂,利用疏水作用力包埋药物DOX,制得具有药物缓释功能的载药体系PIA-g-DDA@DOX. 通过紫外-可见光谱分析,将PIA-g-DDA@DOX与单纯DOX进行比较,并考察该载药体系的载药特性和药物释放特性.

1 实 验

1.1试剂与仪器

衣康酸(IA,分析纯,国药集团化学试剂有限公司)； 十二胺(DDA,分析纯,国药集团化学试剂有限公司)； 过硫酸钾(PPS,分析纯,天津市光复精细化工研究所)； 阿霉素(DOX， 浙江海正药业股份有限公司)； 无水甲醇、 丙酮和四氢呋喃(THF)(优级纯,天津市光复精细化工研究所)； 磷酸氢二钠/磷酸二氢钠(分析纯,天津市光复精细化工研究所).

采用美国Bruker公司生产的IFS66VFT-IR型Fourier变换红外光谱仪(FT-IR)测试样品的FT-IR谱,KBr压片； 采用美国Bruker公司生产的Varina Unity-300型(300 MHz)核磁谱仪测试样品的核磁,重水为溶剂,TMS为内标； 通过美国Brookhaven Instruments公司生产的Zeta电位分析仪测试动态光散射(DLS)； 采用日本SHIMADZU公司生产的UV-2450型UV-Vis光谱仪测试样品的紫外光谱. 采用美国Waters公司生产的410型凝胶渗透色谱/光散射仪(GPC/LS)测定聚合物的分子量及其分布,水为流动相,流速为1 mL/min.

1.2两亲性梳状聚合物(PIA-g-DDA)的合成

1.2.1 PIA的合成 先将IA单体 (衣康酸6.67 g,50.0 mmol)和PPS(过硫酸钾0.300 g,0.474 mmol)溶于30 mL水中并置于已充氮气15 min的100 mL圆底烧瓶中， 再将混合物在68 ℃搅拌48 h后用400 mL 0 ℃丙酮沉淀,洗涤3次. 用截留分子量为8 000～14 000的透析袋透析7 d以除去未反应的单体， 提纯后的产物在真空烘箱中干燥48 h. 共合成3种PIA聚合物,改变引发剂质量分数分别为1.8%,3.0%,5.0%,并将产物分别命名为PIA-1,PIA-2,PIA-3， 反应过程如图1所示.

图1 PIA的合成路线Fig.1 Synthetic route of PIA

图2 PIA-g-DDA的合成路线Fig.2 Synthetic route of PIA-g-DDA

1.2.2 聚衣康酸接枝十二胺(PIA-g-DDA)的合成 DDA与PIA的接枝反应如图2所示. 向装有20 mL甲醇的圆底烧瓶内加入0.200 g PIA(含—COOH 3.08 mmol). 将5 mL DDA甲醇溶液(含DDA 0.190 g,1.03 mmol)加入反应器内. 于30 ℃电磁搅拌16 h,所以溶剂为二氯乙烷(EDC)和DMAP(4-二甲氨基吡啶). 反应结束后,将所得白色乳浊液用0 ℃丙酮溶液洗涤数次. 所得固体真空干燥24 h,得到白色粉末.

通过控制投料比的方法分别对PIA进行不同链段比接枝,每种PIA均合成羧基与DDA物质的量比分别为2,4,6,8的4种PIA-g-DDA,得到的聚衣康酸梳状聚合物通过重量法计算,所得产率均大于90%.

1.2.3 聚衣康酸梳状聚合物包覆阿霉素体系(PIA-g-DDA@DOX)的制备 将DOX溶于纯净水中,配制质量浓度分别为0,0.04,0.12,0.16,0.20 mg/mL的DOX溶液,并测量不同质量浓度对应的吸光度值(OD,480 nm). 以质量浓度为横坐标,OD为纵坐标绘制DOX标准曲线. 根据标准曲线计算包埋率、 载药量和释放量. PIA-g-DDA包埋DOX的过程如图3所示.

图3 PIA-g-DDA@DOX的制备路线Fig.3 Schematic representation of the preparation of PIA-g-DDA@DOX

1) 配制DOX溶液,将一定质量的DOX溶于5 mL水中备用;

2) 将0.05 g PIA-g-DDA置于100 mL圆底烧瓶中,用3 mL THF和0.5 mL水在超声条件下溶解;

3) 在超声条件下向圆底烧瓶内逐滴加入1 mL DOX溶液完成相转移;

4) 旋蒸除去大部分THF,透析30 min除去游离的DOX;

5) 将体系定容至5.0 mL,根据DOX标准曲线计算载药量及包埋率.

聚合物的载药量表达式为

其中:L为载药量(mg/g);m1为PIA-g-DDA的质量(g);m2为包埋DOX的质量(mg).

药物的包埋率表达式为

其中:ω为包封率;m1为DOX总质量(mg);m2为游离DOX质量(mg).

1.2.4 PIA-g-DDA@DOX药物控释 测试不同质量浓度DOX溶液的吸光度,绘制标准曲线. 将5 mL该载药体系装在透析袋内,置于含有100 mL透析液的密封圆底烧瓶内进行透析释放. 每隔一段时间抽取5 mL透析液测定其在480 nm处的OD值(测试结束后重新放回透析液中),得到一定时间内药物释放的特性曲线. 通过使用不同pH的磷酸缓冲溶液作为透析液并调节体系温度为37 ℃,即得到不同pH条件下载药体系的释放曲线. 设置对照样品,配制与待测样品相同OD的纯DOX样品溶液,按相同方法进行不同条件下的透析释放.

2 结果与讨论

2.1PIA的GPC测试

3种聚合物的分子量及其分布列于表1. 由表1可见,随着体系内引发剂用量的增加,聚合物相对分子量逐渐降低.

表1 PSI-DDA的分子量及其分布Table1 Molecular weight and distribution index of PSI-DDA

2.2PIA的核磁表征

对合成的PIA进行核磁共振碳谱表征,测试结果如图4所示.

图4 重水中PIA的13C NMR谱Fig.4 13C NMR spectrum of PIA in D2O

由图4可见,位于δ=180.54与δ=180.17处的信号峰为PIA季碳上羧基的同规排列和间规排列特征峰； 位于δ=176.07与δ=175.82处的信号峰为PIA侧链仲碳上羧基的同规排列和间规排列特征峰； 位于δ=47.63处的信号峰为主链上亚甲基特征峰; 位于δ=45.28处的信号峰为侧链上亚甲基特征峰; 位于δ=36.60处的信号峰为主链上季碳的特征峰.

2.3PIA-g-DDA的FT-IR测试表征

图5 PIA(a)和PIA-g-DDA(b)的FT-IR谱Fig.5 FT-IR spectra of PIA (a) and PIA-g-DDA (b)

图5为接枝前PIA和接枝后PIA-g-DDA的FT-IR光谱测试结果. 由图5可见,PIA发生了明显的峰位变化: 位于1 750 cm-1处表示羧羰基的峰在接枝后明显变小,表明一部分PIA中的羧基与DDA发生反应; 位于942,760 cm-1处的吸收峰为C—N伸缩振动峰,表明DDA已连接到PIA主链上; 位于2 790,2 925 cm-1处的尖峰为亚甲基的伸缩振动峰,表示DDA中含有大量的亚甲基.

2.4PIA-g-DDA的溶液性质表征

将合成不同分子量主链和不同接枝度的十二种聚合物分别形成胶束(将0.05 g聚合物溶于2 mL THF和0.5 mL水中,超声溶解后在超声条件下以1 mL/min滴加水至10 mL,用8 000～14 000透析袋透析2 d除去体系内THF),分别命名为PID-11,PID-12,PID-13,PID-14,PID-21,PID-22,PID-23,PID-24,PID-31,PID-32,PID-33,PID34. PIA-g-DDA胶束的水力直径测量结果列于表2. 由表2可见: 在主链分子量一定的条件下,随着DDA比例的增加,胶束粒径逐渐变小,这是由于疏水链段的增加使链段之间的疏水-疏水作用变强,形成尺寸逐渐变小所致[12]； 在接枝度一定的条件下,随着聚合物主链分子量的增加,所形成胶束的粒径逐渐变大,这是由于每条聚合物主链上连接的疏水链段绝对数量增加,胶束内部疏水基团尺寸增大,所形成胶束尺寸随之增大所致. 将胶束静置 14 d,观察无沉淀产生， 结果列于表3.

表2 PIA-g-DDA胶束的水力直径Table 2 Hydrodynamic diameter index of the micelle formed by PIA-g-DDA

表3 不同n(—COOH)∶n(DDA)的样品沉淀条件*Table 3 Different n(—COOH)∶n(DDA) of precipitation generating

由于芘单体的荧光强度会随周围环境的变化而变化[13],因此芘的溶解度对其荧光强度影响较大,在极性溶剂中的偶极矩作用使芘产生了荧光作用,其荧光强度显著增强. 两亲性接枝共聚物的疏水链段之间由于疏水相互作用力聚集形成胶束的内核,胶束的外壳则由亲水基团组成[14]. 由于芘具有较强的疏水性,在两亲性聚合物胶束体系中,芘会更好地溶解在聚集体的疏水区域,当聚合物的浓度太小不能形成胶束时,芘会从胶束体系中分离,因此芘可作为荧光探针测定形成胶束时的质量浓度,即临界胶束浓度(CMC)[15-18].

配置一定质量浓度的PID-31胶束标准溶液和浓度为4.75×10-4mol/L的芘标准溶液,将胶束的标准溶液分别稀释至特定倍数,分别取10 mL,向每个样品中加入含芘标准溶液4 μL. 表4列出了不同质量浓度胶束溶液中芘荧光I372/I392(I3/I2)的值. 通过对胶束质量浓度对数lgρ和I3/I2做图(图6),可得PID-31的临界胶束质量浓度为2.01×10-2mg/mL.

表4 不同质量浓度聚合物胶束I3和I2的比值Table 4 Ratio of I3 and I2 of pyrene at different mass concentrations of polymer micelle

2.5载药体系PIA-g-DDA@DOX的药物控释

DOX的标准曲线如图7所示. 根据标准曲线可确定PIA-g-DDA包埋DOX的最大载药量及包埋率. 制备载药体系后,用透析方法将游离的DOX除去. 由式(1)可得PIA-g-DDA包埋DOX的最大载药量为420 mg/g. 按照最大载药量进行包埋实验,由式(2)可得药物体系的包埋率为90%,表明当药物/聚合物的质量比小于或等于最大载药量时,聚合物可包埋绝大部分药物.

采用1.2.4方法将PIA-DDA@DOX载药体系在不同pH条件下进行透析释放,结果如图8所示. 由图8可见: 在不同pH条件下,PIA-g-DDA包覆DOX体系的释放速度均比纯DOX的释放速度慢,表明PIA-g-DDA对包埋的DOX具有缓释功能; 在3种pH条件下,纯DOX在1 h内的释放率均大于40%,而经PIA-g-DDA包覆的DOX体系释放率小于15%； PIA-g-DDA包覆DOX体系在12 h的释放率约为纯DOX释放率的30%～45%. 即PIA-g-DDA作为DOX的药物包埋载体可较好包裹药物,延长药物释放时间,达到药物缓释的目的.

图6 PIA-g-DDA质量浓度对lg ρ 值Fig.6 Plot of intensity versus lg ρ for PIA-g-DDA

图7 水溶液中DOX的标准曲线Fig.7 Standard curve of DOX in water solution

图8 不同pH条件下PIA-g-DDA@DOX和DOX的释放曲线Fig.8 Release curves of PIA-g-DDA@DOX and free DOX at different pH values

综上所述,本文合成了不同分子量的PIA和接枝度不同的PIA-g-DDA,并研究了其溶液性质,讨论了接枝率的变化. 通过两亲共聚物疏水链与阿霉素的疏水作用,制备了稳定性较好的药物缓释体系PIA-g-DDA@DOX,该体系载药量大,包埋率高,与单纯药物相比具有较好的缓释功能.

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(责任编辑： 单 凝)

SynthesisofCombAmphiphilicPoly(itaconicacid)andDrugDeliverySystemwithEncapsulatedDoxorubicin

ZHANG Xiaonan1,YANG Bohan2,ZHAO Wai’ou1,WANG Jingyuan2
(1.DepartmentofThyroidCancer,BethunetheFirstHospital,JilinUniversity,Changchun130021,China;
2.CollegeofChemistry,AlanG.MacDiarmidInstitute,JilinUniversity,Changchun130012,China)

Poly(itaconic acid) was successfully synthesized by radical polymerization. Afterwards,comb-shape amphiphilic copolymers PIA-g-DDA were obtained via grafting docecylamine onto the backbone of PIA through amination reaction. Hydrodynamic diameter of the micelle formed by PIA-g-DDA in water was recorded by dynamic light scattering (DLS). The effect of graft density of alkyl on the size of the micelle was investigated,with the results indicating that an increase in the graft level of DDA leads to a decrease in the size of the micelle conversely. Critical micelle concentration (CMC) of the micelle was determined through fluorescence spectrophotometry with pyrene as probe to be 2.01×10-2mg/mL. In the end,the copolymers were employed to encapsulate DOX (DOXorubicin) as a model,namely,drug delivery system PIA-g-DDA@DOX,to demonstrate an ideal encapsulation efficiency and drug loading value,and more importantly sustained release of drugs.

amphiphilic polymer; poly(itaconic acid); sustained-release; doxorubicin

2014-03-27.

张笑男(1982—),女,汉族,硕士， 医师， 从事纳米药物释放的研究,E-mail: zhangxiaonanjd@sina.com. 通信作者： 王静媛(1950—),女,汉族,硕士， 教授,博士生导师,从事医用高分子和功能高分子材料的研究,E-mail: jingyuan@jlu.edu.cn.

国家自然科学基金(批准号: 20904014)和教育部博士学科点专项基金(批准号: 20090061110017).

O63

A

1671-5489(2014)05-1084-07