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蛹虫草子实体虫草多糖提取工艺的优化

2014-09-02殷东林 王锐丽 段鸿斌

江苏农业科学 2014年7期
关键词:提取工艺正交试验优化

殷东林 王锐丽 段鸿斌

摘要:以蛹虫草子实体为材料,研究虫草多糖的提取工艺,探讨热水浸提法、超声波助提法、微波助提法和索氏提取法4种提取方法的效果。结果发现,微波助提法是虫草多糖的最佳提取方法。通过正交试验考察了微波助提法中微波功率、微波时间、提取次数、料液比4个因素对虫草多糖提取效率的影响,建立了提取虫草多糖的最佳工艺,即微波功率420 W、微波处理时间4 min、提取次数3次、料液比1 g ∶40 mL,此时提取率可达9.34%以上。

关键词:蛹虫草;虫草多糖;提取工艺;正交试验;优化

中图分类号: R284.2 文献标志码: A 文章编号:1002-1302(2014)07-0277-02

收稿日期:2013-10-24

基金项目:河南省科技攻关(编号:132102110047)。

作者简介:殷东林(1983—),男,河南潢川人,硕士,讲师,主要从事生物技术的研究。E-mail:ydl669@126.com。蛹虫草[Cordyceps militaris (Linn.)Link]为子囊菌亚门麦角菌目麦角菌科虫草属的模式种[1],是一种药食两用的名贵食用菌。蛹虫草所含的虫草多糖、虫草酸和虫草菌素均高于冬虫夏草,其独特药理作用已日益引起药学界的高度重视。研究表明,虫草多糖是一种半乳甘露聚糖,它能促进淋巴细胞转化,提高血清IgG的抗体含量和机体的免疫功能,增强机体自身抗癌、抑癌的能力。它不仅能激活T、B淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞,还能活化补体、促进细胞因子包括肿瘤坏死因子和白细胞介素生成,从而对免疫系统发挥多方面的调节作用[2-3]。此外,多糖还具有抗炎作用,且效果明显,其发酵液中有抗菌活性物质,对金黄色葡萄球菌、马铃薯芽孢杆菌等均有明显的抑制作用,在研制新型杀菌剂和保鲜剂方面有良好的应用前景[4]。

目前,虫草多糖的提取方法有热水浸提法、碱提取法、稀酸浸提法和酶提取法等。其中,最常用、最简单有效的方法是热水浸提法,首先用蒸馏水浸润物料,再用热水浴浸提,然后利用多糖易溶于水而不溶于高浓度乙醇的性质,用无水乙醇沉淀得到多糖,即采用水提醇沉的办法。

为了进一步提高提取率、缩短提取时间,可用超声波辅助浸提和微波辅助浸提,这2种方法操作简单且不会引入杂质。超声波能破坏细胞和细胞膜结构,增加细胞内容物通过细胞膜的穿透能力,有助于多糖的释放与溶出,超声波使提取液不断振荡,有助于溶质扩散,缩短提取时间,提高有效成分的提取率和原料的利用率[5];微波透过提取溶剂到达物料内部,使之快速升温,进而使其细胞内部压力增大。当压力超过细胞壁所能承受的能力时,细胞壁破裂,胞内有效成分易流出,从而易进入提取溶剂[6]。本研究采取单因素分析法和多因素正交分析法,对虫草多糖提取工艺进行优化,旨在为虫草多糖的提取提供一套快速、高效的方法。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂无水乙醇、浓硫酸、蒽酮,均为市售分析纯;蒸馏水。

1.1.2器材用具高速粉碎机,80目筛,电子天平(上海越平科学仪器有限公司),微量移液器(上海求精生化试剂仪器有限公司),数显恒温水浴锅(上海梅香仪器有限公司),JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机(浙江宁波新芝生物科技股份有限公司),微波炉(广东省佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司),旋转蒸发器RE52-86A(上海亚荣生化仪器厂),DHG-9023AS型电热恒温鼓风干燥箱(浙江宁波东南仪器有限公司),TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.1.3材料蛹虫草由信阳农林学院生物技术系实验室培养。蛹虫草子实体干燥后粉碎,过 80目筛。

1.2方法

1.2.1虫草多糖的提取用单因素分析法确定虫草多糖最佳提取方法:(1)热水浸提法。取干质量 1 g蛹虫草粉,加入30 mL蒸馏水,80 ℃水浴提取 2 h,提取结束后抽滤提取液,用真空旋转蒸发仪将滤液浓缩到适当体积。(2)超声波助提法。取干质量1 g蛹虫草粉,加入55 mL蒸馏水,用超声波细胞破碎仪400 W处理90次,每次5 s,然后转入水浴80 ℃提取2 h,提取结束后抽滤提取液,用真空旋转蒸发仪将滤液浓缩到适当体积。(3)微波助提法。取干质量1 g蛹虫草粉,加入80 ℃蒸馏水40 mL,静置 20 min湿润物料,微波功率为420 W 下辐射1 min,间隔 1 min后再辐射1 min,如此间隔辐射直至总辐射时间达到 4 min,然后转入水浴温度为80 ℃下提取1 h,提取结束后抽滤提取液,用真空旋转蒸发仪浓缩到适当体积。(4)索氏提取法。取干质量1 g蛹虫草粉,用 120 mL 蒸馏水于 80~100 ℃下热回流3次,收集提取液,用旋转蒸发仪浓缩至适当体积。以上4种方法均做3个重复,结果取平均值。得到的提取液浓缩到适当体积后,加入3倍体积的无水乙醇,静置过夜,进行醇析,所得沉淀在45 ℃条件下烘干;再用60 ℃蒸馏水将沉淀溶解,并定容到100 mL,即得粗多糖原始样品溶液。从每组样品溶液中准确吸取 2.5 mL 至100 mL容量瓶中并定容(即将样品提取液稀释40倍),用蒽酮-硫酸法测定样品的吸光度。

1.2.2蒽酮-硫酸法检测多糖含量

1.2.2.1对照品溶液的配制精确称取在105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖 0.05 g,加蒸馏水溶解,转移至100 mL容量瓶中定容,摇匀,即得0.5 mg/mL葡萄糖标准溶液。

1.2.2.22 g/L硫酸蒽酮试液的配制量取浓硫酸 100 mL于烧杯中,精确称取蒽酮 0.2 g加入浓硫酸中,搅拌溶解即得,然后转移至棕色瓶中,现用现配。

1.2.2.3供试品溶液的制备取最后稀释到适当体积的样品提取液,测定样品的吸光度。

1.2.3葡萄糖标准曲线的绘制精确量取葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL,分别置于10 mL容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度,摇匀,分别精确量取上述溶液 1 mL 于具塞试管中,另取蒸馏水1 mL置于25 mL比色管中作空白对照,置冰水浴中,再精确加入蒽酮-硫酸试剂4 mL,然后在沸水浴中加热15 min(自加入沸水中即开始计时),之后用自来水冷却。以空白为参比,在 625 nm波长处测定吸光度。以葡萄糖质量浓度(x)为横坐标、吸光度(y)为纵坐标绘制标准曲线。endprint

1.2.4样品含量测定精确量取样品提取液1 mL,置冰水浴中,再精确加入蒽酮-硫酸试剂 4 mL,然后在沸水浴中加热15 min(自加入沸水中即开始计时),之后用自来水冷却。以蒸馏水为对照,在 625 nm波长处测定吸光度。测得吸光度代入标准曲线方程,计算样品中多糖的含量。

1.2.5提取率计算多糖提取率=测得的多糖含量/蛹虫草粉末质量 ×100%。

1.2.6虫草多糖提取工艺的优化用L9(34)正交试验法研究微波助提法中的4个因素(微波功率、微波时间、提取次数、料液比,分别取3个水平)对虫草多糖提取的影响,以确定最佳提取条件。L9(34)正交试验虫草多糖提取的影响因素及水平见表1。

3结论与讨论

本研究以蛹虫草子实体为材料,研究虫草多糖的提取工艺,探讨热水浸提法、超声波助提法、微波助提法和索氏提取法4种提取方法对虫草多糖提取效果的影响,通过单因素试验确定最佳提取方法为微波助提法,其多糖提取率为6.92%。

通过正交试验考察微波助提法中微波功率、微波时间、提取次数、料液比4个因素对虫草多糖提取率的影响,建立提取虫草多糖的最佳工艺条件,即微波功率420 W、微波处理时间4 min、提取次数3次、料液比1 g ∶40 mL,此时提取率可达934%以上。

由于蛹虫草成分复杂,热提取过程中单糖、水溶性蛋白以及鞣质等一系列杂质也会被一并提出,为多糖的纯化带来困难,所以,本试验所得的多糖含有一定的蛋白质。

热水浸提法是最常用、最简单有效的多糖提取方法,但该方法耗时较长,提取率也有待提高。为了进一步提高提取率、缩短提取时间,本研究确定用微波助提法加以优化。微波能

透过提取溶剂到达物料内部,使之快速升温,进而使其细胞内部压力增大。当压力超过细胞壁所能承受的能力时,细胞壁破裂,胞内有效成分易于流出,从而易于进入提取溶剂。但所用微波功率过大或处理时间过长可能会使有效成分分解,造成损失,所以可通过正交试验确定最佳提取条件。总之,微波辅助萃取技术具有快速、萃取率高、成本低、质量好等优点,是天然产物萃取中一种非常有发展潜力的新型技术。

参考文献:

[1]梁宗琦. 中国真菌志:第三十二卷虫草属[M]. 北京:科学出版社,2007.

[2]吴凤瑶. 蛹虫草多糖的分子结构及生物学活性研究[D]. 镇江:江苏科技大学,2011.

[3]吴光昊,王旻. 蛹虫草多糖的分离及免疫活性的研究[J]. 中国天然药物,2007,5(1):73-76.

[4]宾文,宋丽艳,于荣敏. 人工培养蛹虫草多糖抗炎及免疫作用的研究[J]. 时珍国医国药,2003,14(1):1-2.

[5]秦秀丽,李凤林. 超声波法提取蛹虫草多糖的工艺研究[J]. 江苏农业科学,2011,39(5):378-380.

[6]施英,吴娱明,廖森泰,等. 微波辅助提取蚕蛹虫草多糖的研究[J]. 广东农业科学,2006(11):41-42.endprint

1.2.4样品含量测定精确量取样品提取液1 mL,置冰水浴中,再精确加入蒽酮-硫酸试剂 4 mL,然后在沸水浴中加热15 min(自加入沸水中即开始计时),之后用自来水冷却。以蒸馏水为对照,在 625 nm波长处测定吸光度。测得吸光度代入标准曲线方程,计算样品中多糖的含量。

1.2.5提取率计算多糖提取率=测得的多糖含量/蛹虫草粉末质量 ×100%。

1.2.6虫草多糖提取工艺的优化用L9(34)正交试验法研究微波助提法中的4个因素(微波功率、微波时间、提取次数、料液比,分别取3个水平)对虫草多糖提取的影响,以确定最佳提取条件。L9(34)正交试验虫草多糖提取的影响因素及水平见表1。

3结论与讨论

本研究以蛹虫草子实体为材料,研究虫草多糖的提取工艺,探讨热水浸提法、超声波助提法、微波助提法和索氏提取法4种提取方法对虫草多糖提取效果的影响,通过单因素试验确定最佳提取方法为微波助提法,其多糖提取率为6.92%。

通过正交试验考察微波助提法中微波功率、微波时间、提取次数、料液比4个因素对虫草多糖提取率的影响,建立提取虫草多糖的最佳工艺条件,即微波功率420 W、微波处理时间4 min、提取次数3次、料液比1 g ∶40 mL,此时提取率可达934%以上。

由于蛹虫草成分复杂,热提取过程中单糖、水溶性蛋白以及鞣质等一系列杂质也会被一并提出,为多糖的纯化带来困难,所以,本试验所得的多糖含有一定的蛋白质。

热水浸提法是最常用、最简单有效的多糖提取方法,但该方法耗时较长,提取率也有待提高。为了进一步提高提取率、缩短提取时间,本研究确定用微波助提法加以优化。微波能

透过提取溶剂到达物料内部,使之快速升温,进而使其细胞内部压力增大。当压力超过细胞壁所能承受的能力时,细胞壁破裂,胞内有效成分易于流出,从而易于进入提取溶剂。但所用微波功率过大或处理时间过长可能会使有效成分分解,造成损失,所以可通过正交试验确定最佳提取条件。总之,微波辅助萃取技术具有快速、萃取率高、成本低、质量好等优点,是天然产物萃取中一种非常有发展潜力的新型技术。

参考文献:

[1]梁宗琦. 中国真菌志:第三十二卷虫草属[M]. 北京:科学出版社,2007.

[2]吴凤瑶. 蛹虫草多糖的分子结构及生物学活性研究[D]. 镇江:江苏科技大学,2011.

[3]吴光昊,王旻. 蛹虫草多糖的分离及免疫活性的研究[J]. 中国天然药物,2007,5(1):73-76.

[4]宾文,宋丽艳,于荣敏. 人工培养蛹虫草多糖抗炎及免疫作用的研究[J]. 时珍国医国药,2003,14(1):1-2.

[5]秦秀丽,李凤林. 超声波法提取蛹虫草多糖的工艺研究[J]. 江苏农业科学,2011,39(5):378-380.

[6]施英,吴娱明,廖森泰,等. 微波辅助提取蚕蛹虫草多糖的研究[J]. 广东农业科学,2006(11):41-42.endprint

1.2.4样品含量测定精确量取样品提取液1 mL,置冰水浴中,再精确加入蒽酮-硫酸试剂 4 mL,然后在沸水浴中加热15 min(自加入沸水中即开始计时),之后用自来水冷却。以蒸馏水为对照,在 625 nm波长处测定吸光度。测得吸光度代入标准曲线方程,计算样品中多糖的含量。

1.2.5提取率计算多糖提取率=测得的多糖含量/蛹虫草粉末质量 ×100%。

1.2.6虫草多糖提取工艺的优化用L9(34)正交试验法研究微波助提法中的4个因素(微波功率、微波时间、提取次数、料液比,分别取3个水平)对虫草多糖提取的影响,以确定最佳提取条件。L9(34)正交试验虫草多糖提取的影响因素及水平见表1。

3结论与讨论

本研究以蛹虫草子实体为材料,研究虫草多糖的提取工艺,探讨热水浸提法、超声波助提法、微波助提法和索氏提取法4种提取方法对虫草多糖提取效果的影响,通过单因素试验确定最佳提取方法为微波助提法,其多糖提取率为6.92%。

通过正交试验考察微波助提法中微波功率、微波时间、提取次数、料液比4个因素对虫草多糖提取率的影响,建立提取虫草多糖的最佳工艺条件,即微波功率420 W、微波处理时间4 min、提取次数3次、料液比1 g ∶40 mL,此时提取率可达934%以上。

由于蛹虫草成分复杂,热提取过程中单糖、水溶性蛋白以及鞣质等一系列杂质也会被一并提出,为多糖的纯化带来困难,所以,本试验所得的多糖含有一定的蛋白质。

热水浸提法是最常用、最简单有效的多糖提取方法,但该方法耗时较长,提取率也有待提高。为了进一步提高提取率、缩短提取时间,本研究确定用微波助提法加以优化。微波能

透过提取溶剂到达物料内部,使之快速升温,进而使其细胞内部压力增大。当压力超过细胞壁所能承受的能力时,细胞壁破裂,胞内有效成分易于流出,从而易于进入提取溶剂。但所用微波功率过大或处理时间过长可能会使有效成分分解,造成损失,所以可通过正交试验确定最佳提取条件。总之,微波辅助萃取技术具有快速、萃取率高、成本低、质量好等优点,是天然产物萃取中一种非常有发展潜力的新型技术。

参考文献:

[1]梁宗琦. 中国真菌志:第三十二卷虫草属[M]. 北京:科学出版社,2007.

[2]吴凤瑶. 蛹虫草多糖的分子结构及生物学活性研究[D]. 镇江:江苏科技大学,2011.

[3]吴光昊,王旻. 蛹虫草多糖的分离及免疫活性的研究[J]. 中国天然药物,2007,5(1):73-76.

[4]宾文,宋丽艳,于荣敏. 人工培养蛹虫草多糖抗炎及免疫作用的研究[J]. 时珍国医国药,2003,14(1):1-2.

[5]秦秀丽,李凤林. 超声波法提取蛹虫草多糖的工艺研究[J]. 江苏农业科学,2011,39(5):378-380.

[6]施英,吴娱明,廖森泰,等. 微波辅助提取蚕蛹虫草多糖的研究[J]. 广东农业科学,2006(11):41-42.endprint

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