孟浩浩　许瑞霞　石国庆等

摘要：利用PCR-SSCP方法检测了阿勒泰羊和新疆细毛羊ASIP基因的多态性位点，并分析各 SNPs 位点与被毛毛色之间的关系。结果表明，阿勒泰羊ASIP基因外显子2（g.100～104 bp）存在 5 碱基丢失（D5：AGGAA），外显子4（g.5172 bp：T→A）存在非同义性突变（Ser→Cys）；新疆细毛羊中只发现ASIP基因外显子 2（g.100～104 bp）存在 5 碱基丢失（D5：AGGAA）；阿勒泰羊ASIP基因2处SNPs与被毛毛色不相关（P>0.05），而新疆细毛羊ASIP基因5碱基丢失与被毛毛色极显著相关（P<0.01）。

关键词：新疆细毛羊；阿勒泰羊；ASIP基因；SNPs；毛色；PCR-SSCP

中图分类号： S813.8；S826.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0042-04

收稿日期：2013-10-14

基金项目：国家“863”计划（编号：2011AA100307-06）；国家科技支撑计划（编号：2011BAD28B05-1）；国家自然科学基金（编号：31001002、31360540）。

作者简介：孟浩浩（1988—），男，江苏丰县人，硕士研究生，主要从事绵羊毛色相关基因的筛选与鉴定研究。E-mail：576270343@qq.com。

通信作者：代蓉，副研究员，主要从事绵羊育种及养羊技术推广等工作。Tel：（0993）6683760；E-mail：dairong1@163.com。哺乳动物体内的色素分布广泛、种类多样，大量研究表明，黑色素细胞产生的酪氨酸源性色素（真黑素、褐黑素）是影响皮毛颜色的主要因素[1]。褐黑素为溶于碱的圆形红色颗粒，使皮肤、毛发表现为黄色、红色；真黑素比褐黑素难溶解，使皮肤和毛发表现为黑色、褐色[2]。动物表皮和毛囊中真黑色素、褐黑素的相对表达量最终决定了动物毛色。

ASIP是影响绵羊毛色的主要候选基因，在色素形成中起重要的调控作用[3]。它与α-促黑色素细胞激素（α-MSH）竞争结合黑素皮质激素受体1（melanocortin-1，MC1R），使MC1R结构改变，抑制环磷酸腺苷（cAMP）酶系统，引起cAMP 水平下降，通过级联反应，促进褐黑素的产生[4-5]。ASIP基因在绵羊基因组中存在多个拷贝和等位基因[6]，编码的鼠灰信号蛋白由133个氨基酸残基组成。在研究藏羊、哈尔达绵羊等品种时发现，ASIP基因与绵羊的毛色相关。人、马、牛、羊驼、兔、狗等物种ASIP基因多态性位点与毛色和肤色之间关系的研究已有大量报道，研究发现突变位点与毛色相关，但目前尚未深入探讨细毛羊该基因与毛色形成的关系。因为细毛羊经长期选育均为白色个体，由于生物多样性和种质特性的关系，其他绵羊、山羊的研究结果并不能完全反映新疆细毛羊中该基因的特点。笔者长期从事优质细毛羊的选育研究，在实际生产中发现了自然突变的黑色细毛羊个体，这为开展ASIP基因与细毛羊毛色形成的关系提供了极好的试验样本。本研究以新疆细毛羊及阿勒泰羊为模型，探究 ASIP 基因SNPs 位点与绵羊毛色的关系，以期为探明绵羊毛色形成的调控机制奠定基础。

1材料与方法

1.1样本采集及 DNA 提取

采集新疆农垦科学院试验羊场成年阿勒泰羊（黄色、白色各 1 只，黑色 11 只，棕色 96 只）及新疆细毛羊（棕色5只，白色60只）耳缘组织（图1），利用酚-氯仿法提取组织DNA，经琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测的合格样品放于-20 ℃保存备用。

1.2主要试剂

蛋白酶K、无水乙醇、Tris-饱和酚、氯仿、常规PCR试剂（TaKaRa），琼脂糖、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺（Sigma公司），DL 100 bp Marker（天根 Code：DM109），变性加样缓冲液[甲酰胺98%、10 mmol/L EDTA（pH值 8.0）、 0.25%溴酚蓝、 0.25%二甲苯青]、琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根 Code：DP209）。

1.3引物设计

根据GenBank 数据库中绵羊 ASIP基因（Genbank 登录号：EU420022）设计引物（表 1），这3对引物分别位于ASIP基因的外显子 2、3、4上，引物由 Invitrogen 公司合成。

1.4ASIP基因核苷酸多态性分析

2.4ASIP各基因型频率与基因频率

从表3、表4可知，本研究中检测到阿勒泰羊、新疆细毛羊外显子2有2种基因型（N5N5、N5D5），在阿勒泰羊中N5N5基因型频率较高，而新疆细毛羊中结果恰好相反。经卡方检验发现，该基因型与阿勒泰羊毛色不存在相关性（P>0.05），但与新疆细毛羊毛色显著相关（P<0.01）。外显子4中检测到2种基因型（AB、BB），经卡方检验发现，该位点基因型与2种绵羊的毛色不相关（P>0.05）。

3结论与讨论

阿勒泰羊毛色以棕红色或淡棕色为主，纯黑、纯白、纯黄的阿勒泰羊不多[7]；新疆细毛羊以白色为主，黑色或其他毛色的新疆细毛羊稀少。在本研究样品中，棕色阿勒泰羊和白色新疆细毛羊占多数，纯黑、纯白、纯黄的阿勒泰羊及棕色细毛羊个体数较少。为使研究结果更为直观，本研究没有采集头部、四肢与身体毛色相异的阿勒泰羊组织样。

ASIP是影响绵羊毛色的主要候选基因，在绵羊基因组中存在多个拷贝和等位基因[6]。ASIP 编码的鼠灰信号蛋白由133个氨基酸残基组成，在不同品种绵羊中 SNPs 位点存在差异：藏羊的ASIP基因外显子 2 只存在 5 bp（g.100～104 bp：AGGAG）的丢失[8]；澳大利亚美利奴绵羊[6]、哈萨克羊[9]外显子 2 既存在 5 bp（g.100～104 bp：AGGAG）丢失，又存在 9 bp（g.10～19 bp：AGCCGCCTC）丢失。研究表明，美利奴羊的显性白色受 ASIP基因、AHCY 编码区及 ITCH 启动子区域的影响，多拷贝的ASIP基因编码区受临近的多个ITCH启动子调控，导致显性白色表型[6]；有关藏羊毛色与ASIP基因拷贝数的研究表明，藏羊纯白与纯黑表型与ASIP基因拷贝数不相关[8]。本研究结果与以往对藏羊[8]、美利奴羊[6]、哈萨克羊[9]的研究结果一致：ASIP基因外显子 3中没有发现 SNPs位点。阿勒泰羊ASIP基因外显子 2 存在 5 bp（g.100～104 bp：AGGAG）丢失，这与已往研究结果相同。但在供试阿勒泰羊、新疆细毛羊样品中没有发现该品种绵羊存在 9 bp丢失，可能是由于部分毛色表型的羊个体数较少，致使其没有被检测到，可通过扩大样品量再筛查。

参考文献：

[1]刘琳玲，邢秀梅，王桂武，等. Agouti基因的研究进展[J]. 黑龙江畜牧兽医，2011（8）：37-38.

[2]庞有志.兔的毛色遗传与家兔育种[J]. 中国养兔，2008（10）：30-35.

[3]Royo L J，Alvarez I，Arranz J J，et al. Differences in the expression of the ASIP gene are involved in the recessive black coat colour pattern in sheep：evidence from the rare Xalda sheep breed[J]. Animal Genetics，2008，39（3）：290-293.

[4]吴宇婷. 哺乳动物毛色形成机制与影响因素[J]. 四川动物，2011，30（6）：1003-1007.

[5]姜俊兵，赵志军，贺俊平，等. Agouti在不同颜色被毛羊驼皮肤组织中的表达[J]. 畜牧与兽医，2007，39（4）：38-41.

[6]Norris B J，Whan V A. A gene duplication affecting expression of the ovine ASIP gene is responsible for white and black sheep[J]. Genome Research，2008，18（8）：1282-1293.

[7]王大星，徐冬. 阿勒泰羊品种遗传资源调查报告[J]. 草食家畜，2009（2）：38-40.

[8]韩吉龙，岳耀敬，裴杰，等. 藏羊刺鼠信号蛋白基因（Agouti）的多态性及不同颜色被毛皮肤组织中Agouti与小眼畸形相关转录因子基因（MITF）表达的定量分析[J]. 农业生物技术学报，2013，21（3）：338-347.

[9]李洪涛，曾献存，张文祥，等. 哈萨克绵羊MC1R和ASIP基因多态性及表达量与被毛颜色表型相关性的研究[J]. 畜牧兽医学报，2013，44（3）：366-375.

[10]夏热甫·居马依，刘江虎，古丽沙拉·加别力. 关于阿勒泰羊品种发展趋势的探讨[J]. 新疆畜牧业，2011（3）：43-44.

[11]巴登加甫，木拉提汉，杨菊清，等. 新疆细毛羊沧桑五十年[J]. 中国草食动物，2006，26（1）：38-39.

[12]Fontanesi L，Dallolio S，Beretti F，et al. Coat colours in the Massese sheep breed are associated with mutations in the agouti signalling protein（ASIP） and melanocortin 1 receptor（MC1R） genes[J]. Animal，2011，5（1）：8-17.

[13]王乐，高维明，郑文新，等. 新疆富蕴县阿勒泰羊毛绒品质分析[J]. 草食家畜，2011（2）：31-32.

参考文献：

[1]刘琳玲，邢秀梅，王桂武，等. Agouti基因的研究进展[J]. 黑龙江畜牧兽医，2011（8）：37-38.

[2]庞有志.兔的毛色遗传与家兔育种[J]. 中国养兔，2008（10）：30-35.

[3]Royo L J，Alvarez I，Arranz J J，et al. Differences in the expression of the ASIP gene are involved in the recessive black coat colour pattern in sheep：evidence from the rare Xalda sheep breed[J]. Animal Genetics，2008，39（3）：290-293.

[4]吴宇婷. 哺乳动物毛色形成机制与影响因素[J]. 四川动物，2011，30（6）：1003-1007.

[5]姜俊兵，赵志军，贺俊平，等. Agouti在不同颜色被毛羊驼皮肤组织中的表达[J]. 畜牧与兽医，2007，39（4）：38-41.

[6]Norris B J，Whan V A. A gene duplication affecting expression of the ovine ASIP gene is responsible for white and black sheep[J]. Genome Research，2008，18（8）：1282-1293.

[7]王大星，徐冬. 阿勒泰羊品种遗传资源调查报告[J]. 草食家畜，2009（2）：38-40.

[8]韩吉龙，岳耀敬，裴杰，等. 藏羊刺鼠信号蛋白基因（Agouti）的多态性及不同颜色被毛皮肤组织中Agouti与小眼畸形相关转录因子基因（MITF）表达的定量分析[J]. 农业生物技术学报，2013，21（3）：338-347.

[9]李洪涛，曾献存，张文祥，等. 哈萨克绵羊MC1R和ASIP基因多态性及表达量与被毛颜色表型相关性的研究[J]. 畜牧兽医学报，2013，44（3）：366-375.

[10]夏热甫·居马依，刘江虎，古丽沙拉·加别力. 关于阿勒泰羊品种发展趋势的探讨[J]. 新疆畜牧业，2011（3）：43-44.

[11]巴登加甫，木拉提汉，杨菊清，等. 新疆细毛羊沧桑五十年[J]. 中国草食动物，2006，26（1）：38-39.

[12]Fontanesi L，Dallolio S，Beretti F，et al. Coat colours in the Massese sheep breed are associated with mutations in the agouti signalling protein（ASIP） and melanocortin 1 receptor（MC1R） genes[J]. Animal，2011，5（1）：8-17.

[13]王乐，高维明，郑文新，等. 新疆富蕴县阿勒泰羊毛绒品质分析[J]. 草食家畜，2011（2）：31-32.

参考文献：

[1]刘琳玲，邢秀梅，王桂武，等. Agouti基因的研究进展[J]. 黑龙江畜牧兽医，2011（8）：37-38.

[2]庞有志.兔的毛色遗传与家兔育种[J]. 中国养兔，2008（10）：30-35.

[3]Royo L J，Alvarez I，Arranz J J，et al. Differences in the expression of the ASIP gene are involved in the recessive black coat colour pattern in sheep：evidence from the rare Xalda sheep breed[J]. Animal Genetics，2008，39（3）：290-293.

[4]吴宇婷. 哺乳动物毛色形成机制与影响因素[J]. 四川动物，2011，30（6）：1003-1007.

[5]姜俊兵，赵志军，贺俊平，等. Agouti在不同颜色被毛羊驼皮肤组织中的表达[J]. 畜牧与兽医，2007，39（4）：38-41.

[6]Norris B J，Whan V A. A gene duplication affecting expression of the ovine ASIP gene is responsible for white and black sheep[J]. Genome Research，2008，18（8）：1282-1293.

[7]王大星，徐冬. 阿勒泰羊品种遗传资源调查报告[J]. 草食家畜，2009（2）：38-40.

[8]韩吉龙，岳耀敬，裴杰，等. 藏羊刺鼠信号蛋白基因（Agouti）的多态性及不同颜色被毛皮肤组织中Agouti与小眼畸形相关转录因子基因（MITF）表达的定量分析[J]. 农业生物技术学报，2013，21（3）：338-347.

[9]李洪涛，曾献存，张文祥，等. 哈萨克绵羊MC1R和ASIP基因多态性及表达量与被毛颜色表型相关性的研究[J]. 畜牧兽医学报，2013，44（3）：366-375.

[10]夏热甫·居马依，刘江虎，古丽沙拉·加别力. 关于阿勒泰羊品种发展趋势的探讨[J]. 新疆畜牧业，2011（3）：43-44.

[11]巴登加甫，木拉提汉，杨菊清，等. 新疆细毛羊沧桑五十年[J]. 中国草食动物，2006，26（1）：38-39.

[12]Fontanesi L，Dallolio S，Beretti F，et al. Coat colours in the Massese sheep breed are associated with mutations in the agouti signalling protein（ASIP） and melanocortin 1 receptor（MC1R） genes[J]. Animal，2011，5（1）：8-17.

[13]王乐，高维明，郑文新，等. 新疆富蕴县阿勒泰羊毛绒品质分析[J]. 草食家畜，2011（2）：31-32.