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海南省特有安诺兰ISSR体系的优化

2014-09-02任军方姜殿强云勇

江苏农业科学 2014年7期
关键词:优化

任军方+姜殿强+云勇

摘要:以海南省特有安诺兰为基因组材料,采用改进的CTAB法提取安诺兰叶片中的基因组DNA,通过单因素试验,对ISSR-PCR反应体系中各影响因子进行优化和筛选,建立适合海南安诺兰的ISSR-PCR反应体系:15 μL PCR反应体积,10×PCR Buffer,200 μmol/L dNTPs,0.5 μmol/L引物,1.5 mmol/L Mg2+,1.0 U Taq DNA聚合酶,40 ng模板DNA。

关键词:安诺兰;ISSR-PCR;优化

中图分类号: Q949.718.43;S682.310.2 文献标志码: A 文章编号:1002-1302(2014)07-0039-03

收稿日期:2013-10-17

基金项目:海南省自然科学基金(编号:310062)。

作者简介:任军方(1980—),女,河北石家庄人,助理研究员,研究方向为热带花卉种质资源学。E-mail:renjunfang808@163.com。

通信作者:云勇,副研究员,研究方向为热带作物种质资源创新与利用。E-mail:yyong-3027@163.com。安诺兰[Anota hainanensis (Rolfe)Schltr]为兰科安诺兰属植物,海南省特有种,产于海南省中南部低海拔丘陵地区,热带附生兰,附生于低海拔丘陵地区的枫树上。安诺兰在春节前后开花,花朵清丽、密集而芳香,是极好的新春贺岁花卉。

ISSR(inter simple sequence repeat)标记即简单重复序列区间DNA标记,是由Zietkiewicz等于1994年提出的一种新型分子标记技术[1],它利用基于SSR而设计的寡核苷酸引物来检测2个SSR之间的一段短DNA序列差异。该技术的优点是所需DNA量少、多态性好、无须预知研究对象基因组序列等[2],因此该技术已被广泛用于品种鉴定[3]、基因定位及遗传多样性分析[4-5]。由于ISSR技术也是基于PCR的一种分子标记技术,所以它同其他分子标记技术一样,结果容易受多种因素干扰,如模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物浓度等都能影响扩增结果,甚至其中一个因素改变都会影响扩增条带的位置或使其消失,从而影响整个试验结果,因此在研究时应先建立合适的反应体系并对其进行优化[6-10]。本研究对海南省特有安诺兰ISSR反应体系进行探索,旨在建立适于安诺兰的ISSR反应体系。

1材料与方法

1.1材料

供试安诺兰来自于海南省农业科学院园林花卉研究所兰圃,试验地点在海南省农业科学院园林花卉研究所实验室。

1.2试剂

Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA marker等试剂均购于上海生工生物工程有限公司。100条ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供的序列,由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3试验方法

1.3.1采用改良CTAB法提取DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳,以DL 2000为标准,检查所得DNA的分子量、含量、纯度、完整性,并将DNA浓度稀释至40 ng/μL。

1.3.2ISSR-PCR正交试验设计采用正交试验建立 ISSR-PCR 反应体系并进行优化,参照陶兴林等的方法[11-15]设置各个因素,考察模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物浓度等4个因素对ISSR反应体系的影响,设定5个水平,建立U20(54)均匀设计表(表1、表2),确立海南安诺兰 ISSR-PCR 反应体系,每个处理重复2次。

3结论与讨论

ISSR技术已被广泛用于植物种质资源鉴定、植物遗传多样性等研究。ISSR扩增以PCR扩增为基础,因此影响PCR扩增的因素如引物浓度、dNTPs浓度、模板浓度等都会对ISSR扩增产生影响。植物种类、试验条件不同,各因子间相互影响产生的扩增结果也不相同,本研究中不同处理下的扩增条带存在差异,因此须要对这些因子进行优化,选择最佳组合。DNA Taq酶浓度是影响试验结果的重要因素,其浓度过高容易产生非特异性扩增产物;浓度过低时,扩增产物效率下降。dNTPs浓度太高容易引起错配,浓度过低会影响扩增效率。引物浓度则会影响扩增产物质量,浓度偏高会产生非特异性扩增,浓度太低则无法进行有效扩增。另外,退火温度、循环次数等也是反应体系建立和优化的重要因素[16-17]。

本研究采用单因素与正交试验相结合的方法,对PCR各单因子进行研究,建立了适合海南安诺兰的ISSR反应体系,即:总体积15 μL,10×PCR Buffer(含Mg2+)2.0 μL,200 μmol/L dNTPs,0.5 μmol/L引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,模板DNA 40 ng,其他为超纯水。并用ISSR引物823检验了该体系的稳定性和可靠性,为海南安诺兰的种质资源分析奠定了基础。

参考文献:

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