刘长江 王小敏 于英 宁佳 张岳雯

·论著·

含钾通道四聚化结构域15基因多态性与冠心病的关系及意义

刘长江 王小敏 于英 宁佳 张岳雯

目的 探讨含钾通道四聚化结构域15 (KCTD15)基因单核苷酸多态性(SNP)位点rs11084753与冠心病的遗传易感性的关系。方法确诊的冠心病患者426例(男216例，女210例)为病例组，非冠心病患者及正常体检者436例(男224例，女212例)作为对照组，利用聚合酶链式反应( PCR) 分析技术及DNA直接测序技术，对2组EDTA抗凝血KCTD15基因 rs11084753(A/G)多态位点进行分型，按该位点等位基因A和G的出现情况将基因型分为AA、AG、GG三种类型。采用因素回归分析统计该多态位点与冠心病易感性的关系。检测所有研究对象的血脂水平。结果病例组血脂指标中TC、TG、LDL-C与对照组比较明显升高，而HDL-C则明显低于对照组；病例组患者吸烟、饮酒及阳性家族史的比例均高于对照组(P均<0.05)。AA、AG、GG基因型在病例组中的分布频率分别为52.4%、32.6%和15.0%，在对照组中分别是76.1%、18.4%和5.5%，2组基因型频率分布差异有统计学意义(χ2=8.174，P=0.0098)。多因素分析显示，携带rs11084753(A/G)多态位点G变异等位基因与冠心病的遗传易感性有明显相关关系(OR=5.94， 95%CI=3.02～22.31，P<0.01) 。结论KCTD15基因 rs11084753(A/G)多态位点与河北地区汉族人冠心病遗传易感有关。

含钾通道四聚化结构域15基因；单核苷酸多态性；冠心病；遗传易感性

冠心病是严重威胁人类生命的主要心血管系统疾病,其病因是冠状动脉粥样硬化改变导致血管腔栓塞[1]。近年来动脉粥样硬化性疾病在发展中国家和发达国家的发病率和死亡率都不断升高，已成为主要死亡原因之一。在我国冠心病的危害也日趋严重，已成为研究者的关注热点。学者们从遗传因素、环境因素等多方面对冠心病危险因素和发病机制等方面进行研究，认为遗传因素在冠心病的发生与发展过程中的重要作用[2,3]，但具体的情况还不明确。近年来有研究发现含钾通道四聚化结构域15 (potassium channel tetramerization domain containing 15，KCTD15)基因与肥胖、糖耐量异常等代谢异常性疾病有关[4,5]，而肥胖是冠心病发病的重要危险因素[6]，而KCTD15基因是否与冠心病有关报道尚不多见。因此本研究通过检测河北局部地区汉族患者冠心病患者血液KCTD15基因的SNP位点rs11084753多态性的关系，分析了KCTD15基因与冠心病的发生发展的相关性，为揭示冠心病的发病机制并更好的对该病进行预防提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2011年3月至2013年9月在我院治疗，经冠状动脉造影、冠脉CTA等检查确诊为冠心病的住院患者，共426例。冠心病诊断标准参照国际心脏病学会及WHO临床命名《缺血性心脏病的命名及诊断标准》，影像学检查显示主要动脉中至少有1支内径狭窄>50%。病例组中男216例，女210例；年龄44～69岁，平均年龄(53±9)岁。对照组为同期于我院住院的患者及健康体检者共436例，均排除患冠心病。对照组中男224例，女212例；年龄42～67岁，平均年龄(52±11)岁。所有冠心病患者和正常对照个体均无血缘关系，所有纳入对象如有感染、肿瘤、严重肝肾疾病、心肌炎、糖尿病、先心病、心肌病、自身免疫性疾病、心肌炎、严重创伤等疾病均排除。所有标本均收集年龄、性别比、吸烟史、饮酒史、收缩压和舒张压、胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、冠心病家族史等资料。所有入选个体均为河北地区出生并长期居住，均为汉族，自愿签署知情同意书,并得到了河北省唐山市乐亭县医院医学伦理委员会的批准。

1.2 试剂与仪器 TIANamp血液基因组DNA提取试剂盒(TianGen)，Taq DNA 聚合酶和DL500TM DNA Marker(Takara公司)，Mastercycler R gradient PCR仪(Eppendorf公司)，ABI PRISM 377 DNA 测序电泳仪(ABI公司) 。

1.3 血液标本收集 所有受试对象均无影响脂类代谢的疾病，未用影响糖脂代谢药物。所有研究对象空腹12 h，次日清晨抽取静脉血，取4 ml置于EDTA抗凝管中，用于提取DNA；另取4 ml，分离血清，进行血脂指标检测。

1.4 基因多态性检测(直接测序法)

1.4.1 基因组DNA提取：EDTA-K2抗凝血400 μl按照天根血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)说明书提取基因组DNA。-80℃保存备用。

1.4.2 PCR扩增KCTD15基因片段：引物设计采用生物学软件Primer 5.0，并与GenBank进行比对。引物序列为上游5＇-GAACAACCCAAATCCCCATC-3＇，下游5＇-ACAGGCACCCACCACCAC-3＇。PCR反应体系：共20 μl，包括：DNA模板1 μl，上下游引物各1 μl，KOD plus 0.5 μl，Buffer 2 μl，dNTP Mixture 1 μl，双蒸水13.5 μl。PCR反应采用聚合酶链反应技术，反应条件见参考文献[7]。所得产物进行特异性检验。

1.4.3 核苷酸序列分析：将PCR扩增产物纯化后直接测序。为保证测序结果的可靠性，均双向测序。测定结果用DNAMAN软件(V6.0.3.99汉化版)与GenBank公布的KCTD15基因序列进行比对。

2 结果

2.1 2组一般情况比较 2组年龄、血压无明显差异(P>0.05)；而病例组血脂指标中TC、TG、LDL-C与对照组比较明显升高，而HDL-C则明显低于对照组(P均<0.05)。冠心病组吸烟、饮酒及阳性家族史的比例均高于对照组(P均<0.05)。见表1。

一般情况病例组(n=426)对照组(n=436)t(χ2)值P值年龄(年)53±952±111．3410．180SBP(mmHg)121±27117±281．8500．065DBP(mmHg)78±1077±131．5580．120TC(mmol/L)5．5±1．3∗4．9±1．17．321<0．001TG(mmol/L)2．5±1．0∗2．0±1．06．685<0．001HDL⁃C(mmol/L)1．1±0．8∗1．4±0．9-5．286<0．001LDL⁃C(mmol/L)3．2±1．1∗2．5±1．08．815<0．001BMI(kg/m2)27．4±2．5∗24．4±2．119．183<0．001吸烟[例(%)]115(27．0)∗55(12．6)28．145<0．001饮酒[例(%)]154(36．2)∗96(22．0)20．898<0．001家族史[例(%)]109(25．6)∗74(17．0)9．5620．002

注：与对照组比较，*P<0.05

2.2 KCTD15基因 rs11084753位点多态性分析结果 PCR产物纯化后送往北京三博远志公司进行直接双向测序。测序结果发现该位点存在等位基因A和G，基因型分为AA、AG、GG三种类型。见图1。

图1 KCTD15基因 rs11084753位点多态性分析的测序结果

2.3 KCTD15基因 rs11084753位点基因多态性分析结果 KCTD15基因 rs11084753位点等位基因G在冠心病组频率为0.3134，明显高于在对照组的频率0.1468。冠心病组GG及AG基因型明显高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 KCTD15基因 rs11084753位点基因型和等位基因频率在冠心病组及正常组分布情况 例(%)

注：与对照组比较,*P<0.05

2.4 KCTD15基因rs11084753位点突变与冠心病的关系 KCTD15基因 rs11084753位点与冠心病有相关关系。与A/G基因型、A/A基因型相比，G/G基因型能显著性的增加冠心病的风险。OR(95%CI)值为5.33(2.62～19.77)，调整了性别、年龄、吸烟史、饮酒史、收缩压和舒张压、TC、TG、HDL-C之后为5.94(3.02～22.31)。见表3。

表3 KCTD15基因 rs11084753位点与冠心病的相关关系

3 讨论

近年来，虽然冠心病得到了世界范围内学者和医务工作者的重视，但冠心病的发病率和死亡率在发达国家和发展中国家仍呈现快速上升趋势，危害性不断增高。冠心病的发生是多种因素共同作用导致的，与遗传、不良生活习惯、血脂异常等因素有关[8,9]。本研究也发现，与对照组比较，冠心病患者吸烟、饮酒的比例更高，血脂指标TC、TG、LDL-C与对照组比较明显升高，而HDL-C则明显低于对照组。同时本研究也发现，冠心病患者的家族史比例更高，这说明遗传因素与冠心病发病密切相关。这与其他研究者的结论一致[10]。在冠心病遗传因素的研究中，关于基因多态性的研究是目前的热点。本研究在此方面做了一定的工作。本研究虽为本院的单中心研究，但所纳入的研究对象样本量较大，且均为汉族人。由于河北省汉族人群较为稳定，故我们认为本研究对于探讨河北省汉族人群基因多态性与冠心病的关系有较好的代表性。

KCTD15基因位于19q13.11，编码含钾通道四聚化结构域 15。KCTD15基因在脑及下丘脑影响食欲及能量平衡区域高表达，是一个调节能量平衡与能量动态平衡的重要信号分子，可能通过神经中枢影响肥胖状态[5]，是导致肥胖的重要候选基因。对大量样本进行全基因组关联研究(GWAS)分析筛选后也发现KCTD15与体重指数(BMI)相关，是肥胖的危险因素[11]。从而在控制饮食和体重稳态中起关键作用。但到目前为止有关KCTD15基因多态性与冠心病之间的研究报道还很少见。因此本研究检测了该基因rs11084753位点多态性的情况，结果发现KCTD15基因rs11084753位点突变与冠心病有密切的关系。

本研究选取了性别年龄相匹配的病例组和对照组，结果显示对照组rs11084753位点AA/AG/GG基因型分别占76.1%、18.4%、5.5%，病例组AA/AG/GG基因型分别占52.4%、32.6%、15%，病例组的GG及AG基因型明显高于正常组，2组之间存在明显的统计学差异，同时病例组等位基因G的频率为0.3134，明显高于在对照组的频率0.1468。KCTD15基因rs11084753位点G/G基因型引发冠心病的危险性OR(95%CI)值 为5.33(2.62～19.77)，调整了性别、年龄、吸烟史、饮酒史、收缩压和舒张压、TC、TG、HDL-C之后为5.94(3.02～22.31)，明显高于AA/AG基因型，因此证明KCTD15基因rs11084753位点突变是导致冠心病发病的独立危险因素。

本研究证实KCTD15基因的SNP位点rs11084753突变与冠心病的发生关系密切，可能是导致冠心病的重要危险因素，因此对于存在冠心病家族史的人群应进行该基因突变性的检测。但本研究还处于初始阶段，有关KCTD15基因rs11084753位点突变后导致冠心病的具体机制尚待进一步研究。

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SignificanceKCTD15genepolymorphismanditscorrelationwithgeneticsusceptibilitytocoronaryheartdisease

LIUChangjiang,WANGXiaomin,YUYing,etal.DepartmentofCardiology,People’sHospitalofLaotingCounty,Hebei,Laoting063600,China

ObjectiveTo explore the significance of rs11084753 site polymorphism of potassium channel tetramerization domain containing 15 (KCTD15) gene and its relationship with genetic susceptibility to coronary heart disease (CHD).MethodsThe 426 patients with CHD including 216 males and 210 females were enrolled as case group,and the other 436 healthy subjects were enrolled as control group.The rs11084753 site polymorphism of KCTD15 was detected by PCR-RFLP and DNA sequencing technology.All the tested subjects were divided into 3 groups (AA,AG,GG) according to the genotypes of rs11084753 site.The levels of serum lipids in both groups were detected simultaneously.The stepwise multiple linear regression analysis was used to analyze the correlation between rs11084753 site polymorphism of KCTD15 gene and genetic susceptibility to coronary heart disease.ResultsAs compared with those in control group,the serum levels of TC,TG,LDL-C were significantly increased in case group,however,the levels of HDL-C were obviously decreased (P<0.05).The proportion of smoking,drinking,family history in case group was significantly higher than that of control group (P<0.05).The distribution frequency of AA,AG,GG genotypes in case group was 52.4%,32.6%,15.0%,respectively,however,which was 76.1%,18.4%,5.5%,respectively in control group,there was a significant difference between two groups (P<0.01).The stepwise multiple linear regression analysis showed that genotype A/G of rs11084753 site was related to genetic susceptibility to CHD (OR=5.94,95%CI=3.02,P<0.01).ConclusionThe rs11084753 site polymorphism (A/G) of KCTD15 gene is related to genetic susceptibility to CHD of Han people in Hebei province.

potassium channel tetramerization domain containing 15 (KCTD15) gene;single nucleotide polymorphisms;coronary heart disease;genetic susceptibility

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.03.002

063600 河北省乐亭县医院内二科(刘长江、王小敏、于英、张岳雯)，药剂科(宁佳)

R 541.4

A

1002-7386(2014)03-0327-04

2013-10-27)