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(1.上海交通大学附属第一人民医院普外科，上海200080；2.安徽理工大学医学院临床外科应用解剖学教研室，安徽 淮南232001)

结肠癌是临床上常见的恶性肿瘤，近年来发病趋势不断上升，上海地区结肠癌发病率已高居全部恶性肿瘤的第2位，仅次于肺癌，死亡率位于第三位[1]。目前，结肠癌手术治疗技术成熟，术后能进行规范性化疗。但是患者5年总体生存率仅达到50%～55%，生存率并没有明显提高，其主要原因是缺少判断预后和预测化疗耐药的灵敏指标，这也是制约目前临床诊治的核心问题[2]。因此，探寻并应用新型预测肿瘤复发与化疗敏感性的分子指标是临床亟待解决的问题[3]。V-ATPase是一种广泛存在于真核细胞的胞质膜及细胞管泡膜系统中的H+泵[4]。新发现V-ATPase基因在

非小细胞肺癌[5]和食管鳞状细胞癌中高表达，而且与化疗耐药高度相关[5-6]，但是，国内外对V-ATPase基因在结肠癌中表达及其意义报道尚少。因此，为了提高结肠癌的术后的治愈率和生存率，本研究通过分析V-ATPase基因在结肠癌中的表达及其与临床病理特征关系，探讨V-ATPase基因对结肠癌生物学的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集上海交通大学附属第一人民医院胃肠外科标本库的68例结肠癌患者肿瘤标本及患者对应的正常组织样本。其中男29例，女39例，患者平均年龄64.22岁。全部为结肠腺癌,其中升结肠癌23例，横结肠癌8例，降结肠癌37例。按美国癌症联合会(AJCC)对结肠癌分期，Ⅰ期5例，Ⅱ期19例，Ⅲ期35例，Ⅳ期者9例。病理检查显示高分化者40例，中等分化者26例，低分化者2例。发现淋巴结转移者8例，无淋巴结转移者60例；有远处转移者14例，无远处转移者54例。术中发现脉管浸润者13例，其余55例无脉管浸润。

1.2 方法

1.2.1 逆转录聚合酶链反应及荧光定量聚合酶链反(qPCR)检测 随机选取20对新鲜冰冻组织，应用Trizol(Invitrogen公司，美国)提取总RNA，然后采用cDNA合成试剂盒(Thermo公司，美国)根据使用说明反转录合成cDNA。最后使用荧光定量检测试剂盒(Thermo公司，美国)，在Eppendoff公司生产的PCR仪上进行Real-time PCR扩增反应。反应中使用的引物序列为：①V-ATPase上游引物序列5’-ATGGCCATGGAGATAGACAGC-3’；②V-ATPase下游引物序列5’-CCATGGCTGCAAAGACGATG-3’；③GAPDH上游引物序列5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’；④GAPDH下游引物序列5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。QPCR反应条件为：起始变性95 ℃时间10 min，45个循环(变性95 ℃时间10 s、退火60 ℃时间30 s、延伸72 ℃时间30 s)。每种实验至少重复3次。V-ATPase变化的2-ΔΔCt用于表示V-ATPase基因的表达量，V-ATPase在结肠肿瘤组织相对配对正常组织中的表达计算公示为：V-ATPase△Ct=(Avg．V-ATPase_Ct-Avg．GAPDH_Ct);V-ATPase△△Ct=(V-ATPase△Ct_tumor-V-ATPase△Ct_non-tumor)。

1.2.2 免疫组织化学方法检测 从标本库中提取本实验随机选取的68对组织样本制作的石蜡切块，并制备厚度为4 μm的切片。然后采用两步法进行免疫组化染色实验，经过脱蜡、尿素消化、3%H2O2封闭和微波修复等步骤后，一抗孵育并4 ℃过夜；次日复温后，抗兔二抗( EnVision)37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次冲洗10 min，显微镜下加DAB(1∶40)显色。经苏木素复染、盐酸乙醇化、脱水和中性树胶封片，并在室温风干后光镜下观察。根据V-ATPase染色强度进行评分，分为：3分(强阳性)、2分(中等阳性)、1分(弱阳性)、0分(阴性)；根据V-ATPase染色阳性面积评分，分为3分(51～100%)、2分(10～50%)、1分(小于10%)、0分(0)。按照我们前期病理评分标准，V-ATPase免疫组化染色总评分为V-ATPase染色免疫染色强度与染色面积评分和[7]：(5～6)分，强阳性；(3～4)分，弱阳性；(0～2)分，阴性。

1.3 统计学方法

使用SPSS 19．0软件进行分析，采用χ2检验或者Fisher’S确切概率法检验。所有比较均为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 V-ATPase基因在结肠癌组织及配对正常组织中 的表达

20对新鲜冰冻组织中V-ATPase mRNA的平均相对表达量分别为(5.37±0.44)和(2.03±0.35)，对特异性PCR扩增产物凝胶电泳结果验证了此结果，P<0.01，差异有统计学意义，见图1。免疫组化染色显示，68例患者肿瘤组织中V-ATPase基因阳性表达者47例(69.1%)，而配对正常肿瘤组织中阳性表达者仅有4例(5.8%)，两组间差异显著，而且V-ATPase阳性表达主要出现在肿瘤组织的胞膜和胞质中。

2.2 V-ATPase基因表达与结肠癌临床病理参数的关系

V-ATPase基因的高度表达与结肠癌患者的T分期(P<0.001)、局部淋巴结转移(P=0.044)、肿瘤远处转移(P=0.049)、AJCC分期(P=0.012)、脉管浸润(P=0.044)以及肿瘤分化程度(P<0.001)有关；但对结肠癌患者的年龄(P=0.342)、性别(P=0.981)和肿瘤发生部位(P=0.393)的影响无统计学意义。Ⅰ～Ⅱ期患者中，V-ATPase阳性表达者为50%(12/24)，Ⅲ～Ⅳ期患者中阳性表率高达79.5%(35/44)。免疫组化实验结果还显示V-ATPase基因在正常组织中不表达或者低表达，进一步证明qPCR检测结果，见表1、图2。这些结果同样提示了V-ATPase基因可能参与了结肠癌的转移和浸润。

表1 V-ATPase表达与结肠癌患者临床病理特征的关系

T：肿瘤组织；N：配对正常黏膜组织

a:正常黏膜组织(阴性)；b:肿瘤组织(阴性)；c:肿瘤组织(弱阳性)；d:肿瘤组织(强阳性)

图2V-ATPase在结肠癌组织中免疫组化EnVinsion法染色(×200)

3 讨论

V-ATPase广泛存在真核生物胞质膜及细胞管泡膜系统中，编码一种能主动转运H+的蛋白。正常情况下V-ATPase蛋白由跨膜的V0亚基和胞质内的V1亚基组成，两种亚基聚合时，能利用分解ATP产生的能量逆浓度梯度转运H+，从而维持细胞内外在一个相对稳定的pH值[4]。在肿瘤细胞中V-ATPase常常过表达，这样不但能抑制细胞内酸化对抗细胞凋亡，而且胞外高浓度H+可以改变蛋白水解酶的活性，增强细胞外基质的分解，进而影响了肿瘤细胞的侵袭、转移等生物学行为[8]。

本文研究结果显示，69.1%结肠癌组织中V-ATPase显示高表达，而配对的正常组织中仅有5.8%的阳性表达率。不论是在mRNA水平还是在蛋白水平，V-ATPase在结肠癌组织中表达均显著高于配对正常组织，说明V-ATPase过表达同时发生在转录和转录后水平。通过分析V-ATPase表达与结肠癌临床病理特征的关系，进一步揭示了V-ATPase与结肠癌临床分期、局部淋巴结转移、远处脏器转移、脉管浸润及肿瘤组织的分化程度显著相关，而与患者年龄、性别和肿瘤发生部位则无明显相关性。从而提示结肠癌中V-ATPase过表达很有可能参与了肿瘤浸润转移。另外，我们还发现随着肿瘤分期的提高，结肠癌中V-ATPase的阳性表达率也也明显升高(Ⅰ～Ⅱ期为50%；Ⅲ～Ⅳ期为79.5%)，这表明结肠癌分期越晚，V-ATPase的阳性表达率越高，也说明V-ATPase的过表达与结肠癌的发展呈正相关。有文献报道，V-ATPase的过表达后能促进MMP(matrix metalloproteinases)分泌，增强肿瘤细胞的侵袭能力，而抑制V-ATPase后，肿瘤细胞的侵袭力大大减弱[8-9]。近来，也有许多研究表明，V-ATPase参与了黑色素瘤、乳腺癌和肝癌的侵袭生长和转移[9-12]，并且与非小细胞肺癌和食管鳞癌的浸润以及化疗耐药有关[5-6]。从而提示V-ATPase在结肠癌的发生发展中也有重要作用，可能成为结肠癌术后预后判断的重要分子标记物和化疗预测的灵敏指标。

V-ATPase过表达与肿瘤的发生发展和化疗耐药关系密切，我们也发现V-ATPase过表达对结肠癌生物学行为有显著影响，但目前V-ATPase对结肠癌发生发展及结肠癌化疗耐药影响的具体机制仍不明确。因此，我们需要进一步探讨V-ATPase对结肠癌发生发展生物学的作用，寻找新的结肠癌诊疗靶点，全面提高结肠癌患者的诊治效果。

[参考文献]

[1] 赵森林，孟 镔，严东旺，等.Bmi-1基因与大肠癌术后相关性研究进展[J].局解手术学杂志，2013，22(13)：306-308.

[2] Graham JS，Cassidy J.Adjuvant therapy in colon cancer[J].Expert Rev Anticancer Ther，2012，12(1)：99-109.

[3] Zhang JX，Song W，Chen ZH，et al.Prognostic and predictive value of a microRNA signature in stage II colon cancer: a microRNA expression analysis[J].Lancet Oncol，2013，14(13)：1295-1306.

[4] Nishi T，Forgac M.The vacuolar (H+)-ATPases--nature’s most versatile proton pumps[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3(2)：94-103.

[5] Lu Q，Lu S，Huang L，et al.The expression of V-ATPase is associated with drug resistance and pathology of non-small-cell lung cancer[J].Diagn Pathol，2013，8(1)：145-152.

[6] Huang L，Lu Q， Han Y，et al.ABCG2/V-ATPase was associated with the drug resistance and tumor metastasis of esophageal squamous cancer cells[J].Diagn Pathol，2012，17(7)：180-187.

[7] Yan DW，Li DW，Yang YX，et al.Ubiquitin D is correlated with colon cancer progression and predicts recurrence for stage Ⅱ～Ⅲ disease after curative surgery[J].Br J Cancer，2010，103(7)：961-969.

[8] Kubota S，Seyama Y.Overexpression of vacuolar ATPase 16-kD subunit in 10T1/2 fibroblasts enhances invasion with concomitant induction of matrix metalloproteinase-2[J].Biochem Biophys Res Commun， 2000， 278(2)：390-394.

[9] Creemers LB， Jansen ID， Hoeben KA， et al.Involvement of V-ATPases in the digestion of soft connective tissue collagen[J].Biochem Biophys Res Commun，1998，251(2)：429-436.

[10] Nishisho T，Hata K，Nakanishi M，et al.The a3 isoform vacuolar type H(+)-ATPase promotes distant metastasis in the mouse B16 melanoma cells[J].Mol Cancer Res，2011，9(7)：845-855.

[11] Hendrix A，Sormunen R， Westbroek W， et al.V-ATPase expression and activity is required for Rab27B-dependent invasive growth and metastasis of breast cancer[J].Int J Cancer，2013，133(4):843-845.

[12] Straud S，Zubovych I，De Brabander JK，et al.Inhibition of iron uptake is responsible for differential sensitivity to V-ATPase inhibitors in several cancer cell lines [J].PLoS One，2010，5(7)：e11629.