张开治，吕 铮，高 键，刘俊志*，崔树森

(1.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033； 2.吉林大学第一医院)

随着多学科协作、合作的不断深入，医学与化学交织，利用各种新型化合物解决医学难题的研究层出不穷，顺铂作为典型的无机抗肿瘤药，广泛的应用于肿瘤治疗，但存在副作用[1]。改进结构后具有新配基的铂复合物在临床试验中并未显示出显著的优势，至今只有Carboplatin和Oxaliplatin投入临床[2，3]，非铂金属化合物的研究因此逐渐受到重视。钴是一种高熔点、稳定性良好的磁性硬金属，在探讨含钴化合物的抗肿瘤活性研究进展中，我们发现多种含钴配合物都对肿瘤细胞表现出明显的抑制作用。Jensen于1959年合成的β-二酮螯合剂具有广泛的螯合能力，并且对金属具有良好的螯合作用[4]，近年来对其抑制超氧负离子自由基O2-能力的发现，将其引入了医学领域。

东北师范大学王晓红课题组和吉林大学李锐课题组成功合成了2，4-戊二酮的钴、钼配合物[Co(acac)2(H2O)2和Mo(acac)2O2]，并用实验证明了该配合物对实体瘤细胞SMMC-7721和SK-OV-3的抑制作用。其实验结果表明，2，4-戊二酮钴的抗肿瘤活性高于2，4-戊二酮钼[5]。本实验选用抗肿瘤活性高的2，4-戊二酮钴为研究对象进行急性毒性实验研究，为可能的新型抗肿瘤药物研发做铺垫。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

β-二酮钴的配合物由东北师范大学多酸化学研究所合成。DMSO，苏木精和伊红(Sigma公司，美国)，其余常规试剂购自北京化工厂。昆明种小鼠，雌雄各半，体重18-22 g，由吉林大学动物实验中心提供，合格证号(吉)2008-0005。精密电子天平(Sartorius公司，德国)，Olympus BX50倒置荧光显微镜(Olympus公司，日本)，电热恒温干燥箱(湖北省黄石市医疗机械厂，中国)， TISSUE—TEKVIP TEC 包埋机(LEICA公司，德国)，脱水机(LEICA公司，德国)，切片机SM 2000R(LEICA公司，德国)。

1.2 急性毒性试验

1.2.1 预备试验方法 采用等体积不等浓度一次性灌胃给药，灌药前先按需要用温超纯水将 β-二酮的钴配合物溶解，配置成不同浓度的溶液，然后再称量每只小鼠的体重，根据体重灌胃给药，给药体积为0.2 ml/10 g体重。灌药前禁食 24 h，只提供充足的清洁饮水。预实验选取小鼠12 只，每组 4 只，起始给药量为3 500 mg/kg体重。给药组4 只小鼠全死则降低剂量一半，未全死则增加剂量一倍，则按 2∶1 的比例向上、向下调整剂量，找出上下限剂量Dm 及Dn。

1.2.2 正式试验方法 选取体重(18-22)g，雌雄各半小鼠 80 只，禁食不禁水 16 h后称重标号，按随机数字表，随机分成8组，每组10只(5只雄性，5只雌性)，分笼饲养。采用等体积不等浓度一次性灌胃给药，灌胃量为 20 ml/kg 体重，给药剂量为 7000、4900、3430、2401、1680、1176、823 mg/kg 体重。灌胃后再禁食4 h，每天观察3次，连续观察 14 天，记录小鼠的中毒表现及死亡动物的数量和时间，并于给药后 7天、14天称重。根据所得试验数据，采用 Bliss 法计算小鼠的半数致死剂量 LD50以及 LD50的 95%可信限(使用急性毒性实验-LD50的 BLISS 运算软件)。

1.3 苏木精 — 伊红染色法

对上述不同剂量组的死亡小鼠进行系统的尸体解剖，14天试验完毕后，对存活小鼠亦逐一进行剖检。急毒试验小鼠脏器切片经二甲苯(Ⅰ)，二甲苯(Ⅱ)脱蜡各15 min，二甲苯/无水乙醇(1∶1)2 min，无水乙醇(100%)5 min，75%乙醇5 min，蒸馏水5 min后，依次在苏木精染色液浸泡5 min，氨水5 s，蒸馏水洗5 s。再经伊红染色液浸泡3 min，后进入固定。75%乙醇5 min，无水乙醇(100%)5 min，二甲苯(Ⅰ)，二甲苯(Ⅱ)各5 min后，中性树胶封片。显微镜下观察。

2 结果

2.1 β-二酮钴的配合物急性毒性上下限测定

在预实验中，β-二酮钴的配合物先以3 500 mg/kg体重灌胃给药，4只小鼠有3只死亡，死亡时间在5 h到12 h之间。随后以7000，1750，875和437.5 mg/kg体重灌胃给药，结果7000 mg/kg体重组4只小鼠全部死亡，时间在1-4 h之间。875 mg/kg体重及以下组未出现小鼠死亡(见表1)。由此测出的 Dm 为 875 mg/kg 体重，Dn为7 000 g/kg 体重。

2.2 β-二酮钴的配合物急性毒性试验及LD50测定

β-二酮钴的配合物给药后 1 h开始出现死亡，死亡前小鼠出现昏睡、皮毛无光泽、体重减轻等中毒症状；12 h后存活小鼠不再死亡，存活24 h后的小鼠生理状态良好未见异常。14天试验结束，进行统计分析，测定β-二酮钴的配合物的半数致死量LD50为 3099.1 mg/kg 体重，LD5为1046.8 mg/kg，LD95为9174.9 mg/kg，LD50的95%可信限为 2428.2-4100.1(见表2)。

表1 β-二酮钴的配合物急性毒性上下限测定

表2 Bliss法测定β-二酮钴的配合物灌胃给药LD50

注：回归方程 y(Probit)=-7.1832+3.489Log(D)，LD50=3099.1mg/kg，LD50(Feiller校正)95%的可信限=2428.2-4100.1，LD5=1046.8 mg/kg LD95=9174.9mg/kg

2.3 病理剖检和组织学观察

对受试小鼠进行解剖观察，β-二酮钴的配合物给药实验组与对照组相比，肝肾未见明显异常，肠道局部可见水肿、灶状坏死、出血。镜下病理观察，可见实验组肾脏未见异常改变，实验组肝脏可见轻、中度肝细胞变性，偶见汇管区淋巴细胞，灶状肝细胞坏死，散在肝细胞再生；可见实验组肠道肠黏膜炎症，局部腺体坏死，肠腔炎性渗出(见图 1)。

3 讨论

急性毒性试验是研究和认识化学物毒性的第一步工作，目的在于测定和计算出受试化合物的致死剂量及其他急性毒性参数，研究受试物在动物体内的动力学变化规律，确定安全性与毒性后，再进行进一步的开发研究，最后在毒副作用和疗效上做出评价判断有无开发价值。急性毒性试验是药物开发的必备检测和前提。在先前的体外实验研究中，东北师范大学王晓红课题组和吉林大学李锐课题组已证实该配合物对实体瘤肝癌SMMC-7721细胞株和卵巢癌SK-OV-3细胞株有明显的抑制作用，故该药物具有成为新型抗肿瘤药物的可能。急性毒性实验为其进一步开展体内实验提供实验参考，为其作为抗肿瘤新药研发提供必要前提，决定其能否进行临床试验或进入市场。

图1 β-二酮钴的配合物给药后病理切片HE染色

我们研究发现β-二酮钴的配合物抗肿瘤机理与细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡相关，但是缺乏β-二酮钴配合物急性毒性资料。测定LD50的95%可信区间为2428.2-4100.1 mg/kg，LD50为3099.1 mg/kg。依据外来化合物毒性分级标准，小鼠一次经口半数致死剂量在1001-10000 mg/kg之间的属于低毒物质[6]，判定β-二酮的钴配合物属于低毒化合物，可以

进行进一步的抗肿瘤药物的研发。随着给药剂量增加，中毒症状也越明显，死亡数量越多，呈明显的剂量-效应关系。进一步实验中，为确保每次实验成功，需注意单次给药剂量。病理剖检和组织学切片观察发现，实验组肾脏未见明显异常，肝脏及肠道均呈现炎性改变，且改变程度与剂量相关。由此推断该化合物肾损害小，肠道及肝脏为急性中毒的主要靶器官，肝脏损害可能存在一过性肝损害可能。病理结果也提示出可在β-二酮的钴配合物给药的同时，给予肠道黏膜保护剂及抑酸药物，从而减少毒性作用。

参考文献：

[1]Dempke W,Voigt W,Grothey A,et al.Cisplatin resistance and oncogenes-a review[J].ANTI-CANCER DRUGS,2000,11(4)：225.

[2]Kelland L.The resurgence of platinum-based cancer chemotherapy[J].Nat Rev Cancer,2007,7(8):573.

[3]Misset JL,Bleiberg H,Sutherland W,et al.Oxaliplatin clinical activity:a review[J].Crit Rev Oncol Hematol,2000,35(2):75.

[4]Jensen B S.The synthesis of phenyl-3-methyl-4-acylpyrazolone-5[J].Acta Chem Scand,1959,13:1668.

[5]Zhang K,Cui S,Wang J,et al.Study on antitumor activity of metal-based diketone complexes[J].Medicinal Chemistry Research,2012,21(7):1071.

[6]Lipnick RL,Cotruvo JA,Hill RN,et al.Comparison of the up-and-down,conventional LD50,and fixed-dose acute toxicity procedures[J].Food Chem Toxicol 33(3):223.