罗卫民，刘越峰，罗湘玉，张 军*

(1.湖北医药学院附属十堰市太和医院 心胸外科，湖北 十堰442000；2.湖北医药学院附属十堰市人民医院)

阿霉素(Doxorubicin，DOX) 是一种广泛应用于肿瘤治疗的蒽环类抗生素，是临床上最有效的抗肿瘤药物之一。尽管其对包括白血病在内的多种恶性肿瘤具有抑制作用，但其蓄积性不可逆性心肌病以及充血性心衰限制了其使用[1]。DOX导致的毒性心肌病原因很多，其中活性氧(ROS)、钙超载以及线粒体损伤介导的心肌细胞凋亡是其重要机制[2]。近年来，某些药用植物在DOX所致的心肌细胞损伤中发挥重要作用[4]，如上调血红素氧合酶(Heme oxygenase-1，HO-1)的表达，从而发挥抗氧化、抗凋亡等作用。金樱子为蔷薇科金樱子(Rosa Laevigata Michx，RLM)的果实，研究发现它具有强大的抗氧化和清除自由基能力[5,6]。本课题组的前期研究结果显示，RLM对DOX诱发的心脏毒性具有一定的保护作用，但其机制尚未明了。本研究旨在观察HO-1在RLM心肌保护作用中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂

DOX购自意大利Pharmacia公司(批号为8NB002-A)，血清LDH和CK-MB试剂盒为Stanbio产品。心肌caspase-3的比色测定试剂盒购自Quantikine。HO-1和Nrf2多克隆抗体购自Santa Cruz。金櫻子购于十堰市中草药材公司，经去籽后用煎药机进行熬煎，提取液浓度为2.0 g/ml。SnPP和其他分析纯试剂主要购自Sigma-Aldrich公司。

1.2 实验分组

成年雄性Wistar大鼠由湖北医药学院实验动物部提供，体重(250±5)g，在SPF环境下给予标准实验室的水和食物饲养2周。大鼠随机分成4组(每组15只)，如下：组1：对照组(15只)，大鼠接受等体积的生理盐水作为阴性对照；组2： DOX组：大鼠连续两周每间隔48h注射DOX(2.5 mg/kg,i.p.) 共6次，使其累积剂量达15 mg/kg。组3：DOX 治疗组：在组2的基础上，大鼠每日给予RLM(5 g/kg)灌胃，DOX停止后，持续RLM灌胃4周。组4：SnPP干预组：在组3基础上，给予20 μmol/kg SnPP腹腔注射，每周3次，持续时间同组3。

1.3 血清CK和LDH活性的测定

采用分光光度计在波长340 nm处测量CK-MB的吸光度。LDH的测量按照南京建成生物工程研究所产品提供的诊断试剂盒进行，计算血清总LDH的活性(U/L)。

1.4 心肌HO-1活性测定

将获取的心肌组织匀浆18 000×g 4℃离心10 min，获取400 μl上清加到反应混合物中(含0.8 mmol/L NADPH、2 mmol/L葡糖糖-6-磷酸盐、0.2U葡糖糖-6-磷酸盐-1脱氢酶、2 mg大鼠肝脏胞浆、100 mmol/L PBS以及10 μmol/L氯化血红素)。反应在黑暗的环境中37℃孵育1h后加入1 ml氯仿终止反应。并在463 nm和530 nm双波长测吸光度值(胆红素吸光系数为40)，以生成的胆红素量表示HO-1活性，单位为nmol/(mg protein.h)，并计算其与对照组的相对值。

1.5 caspase-3活性测定

50 mg心肌组织加入0.8 ml pH7.4的裂解缓冲液中制成匀浆。10 000 g 4℃离心15 min。获取上清用于caspase-3测定。采用间接法测定caspase-3活性，基于caspase-3切除底物分子DEVD-pNA中的发光基团pNA，随后在405nm处测量其吸光度，从而间接反应其活性。

1.6 Western blot检测HO-1表达以及Nrf2核转位

根据试剂盒(Pierce)提供的步骤提取心肌组织中的总蛋白和核蛋白，并测定其浓度。获取100 μg蛋白用于SDS-PAGE。分离的总蛋白或核蛋白随后转印至PVDF膜上(Millipore)，并利用含有质量分数为50 g·L-1脱脂牛奶的TBST封闭1 h，随后加入抗HO-1(1∶500)、β-actin(1∶5 000)、抗Nrf2(1∶1 000)，抗TBP(1∶1 000)的抗体4℃孵育过夜。多次洗涤之后，加入HRP标记的二抗(1∶10 000 稀释)孵育膜1 h。ECL法(Amersham)发光、显影。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 RLM对血清CK-MB和LDH水平的影响

与正常组相比，DOX可导致血清LDH和CK-MB增高(P<0.01)，与DOX处理组相比， RLM可导致血清LDH和CK-MB水平显著降低(表1)，而SnPP处理组中LDH和CK-MB水平明显高于RLM组(P<0.05)，但与DOX组相比差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 RLM对血清CK-MB和LDH水平的影响

aP<0.05 VS 对照组；bP<0.05 VS DOX 组；cP>0.05 VS DOX组

2.2 RLM对心肌HO-1活性的影响

DOX处理后，与对照组大鼠相比，心肌组织中HO-1酶活性轻微增高。而经5 g/kg RLM处理后，HO-1酶活性显著增高。而同时用SnPP处理后，HO-1酶活性明显低于RLM组，但仍高于对照组，见图1。

1.阴性对照；2.DOX模型组；3.DOX+5 g/kg RLM；4.DOX+5 g/kg RLM+SnPP *P<0.05 VS 对照组；#P<0.01 VS DOX 组；△P>0.05 VS DOX组

2.3 RLM抑制caspase-3活性

DOX处理后，心肌组织中caspase-3活性增加了55%。同时经5 g/kg RLM处理后，caspase-3活性有所降低，而SnPP处理能再次上调caspase-3的活性，见图2。

1.阴性对照；2.DOX模型组；3.DOX+5 g/kg RLM；4.DOX+5 g/kg RLM+SnPP *P<0.05 VS 对照组；#P<0.01 VS DOX 组；△P>0.05 VS DOX组

2.4 RLM对心肌组织中HO-1表达的影响

与对照组相比，DOX大鼠心肌组织中HO-1蛋白表达水平有轻微增高，而经RLM处理后，HO-1表达进一步增强(图3)。SnPP处理能再次降低HO-1的表达。而内参β-actin含量保持一致。

1.阴性对照；2.DOX模型组；3.DOX+5 g/kg RLM；4.DOX+5 g/kg RLM+SnPP

2.5 RLM对转录因子Nrf2活化的影响

Western blot结果显示，DOX大鼠心肌组织内细胞核中Nrf2含量与对照组相比增高不明显，而RLM处理后，Nrf2转位水平显著增多，表明RLM能促进Nrf2从细胞浆转移至细胞核中(图4)。

1.阴性对照；2.DOX模型组；3.DOX+5 g/kg RLM；4.DOX+5 g/kg RLM+SnPP

3 讨论

DOX是一种作用于DNA的蒽环类抗生素，它能够对DNA发生嵌入作用，在临床中应用广泛。阿霉素的急性副作用包括恶心、呕吐和心律不整。长期使用后，在线粒体氧化磷酸化作用下，阿霉素和铁相互作用产生大量活性氧，可以破坏心肌，造成肌原纤维损伤或凋亡。HO-1是催化血红素降解为CO、亚铁离子和胆红素的限速酶，并在机体的抗炎症、抗氧化损伤中发挥重要作用[4]，本研究显示，DOX毒性大鼠经RLM处理后，可显著上调HO-1的酶活性以及其蛋白表达。HO-1基因的启动子区域含有转录因子Nrf2的结合位点，本研究也证实RLM能诱导Nrf2从细胞浆转位至细胞核，从而激活Nrf2诱导HO-1表达。

Nrf2是机体一种重要的获得性保护性核转录因子。在非激活情况下，Nrf2通过与抑制物keap1结合于细胞质内。当细胞受到外源性刺激时，Nrf2从keap1中分离出来，转移至细胞核内，从而与应激诱导性基因包括HO-1的启动子区域的抗氧化剂应答元件结合[5]。本研究发现RLM处理后，Nrf2转位增加，这与心肌组织中HO-1蛋白表达以及酶活性的趋势一致，表明RLM诱导HO-1的表达可能是由于Nrf2的活化所致。HO-1的代谢产物如CO和胆绿素在多种肺部疾病包括ALI中发挥抗氧化和抗炎症作用，包括抑制促炎症细胞因子、趋化因子、ROS形成[6]。为了进一步评价HO-1在RLM的保护效应中的作用，在干预过程中加入SnPP，对RLM的保护作用进行了分析。结果表明，DOX模型大鼠血清LDH和CK-MB显著增高，而经RLM处理后，这些心肌损伤指标显著降低。同时给予SnPP处理后，能显著逆转RLM的保护效应。这表明RLM是通过上调HO-1蛋白的表达并上调其酶活性，从而发挥对心肌细胞的保护作用。

DOX致心肌细胞损伤的机制很多，包括离子和自由基假说、代谢机制和凋亡机制。心肌细胞是终末分化细胞，多种抗肿瘤药物可引起其坏死或凋亡，从而引起心肌细胞减少而导致心脏收缩功能不足。研究显示，DOX可通过内源性和外源性机制引起心肌细胞凋亡，最终激活下游caspase-3，6和7。一旦caspase被激活，细胞即进入凋亡执行阶段。本研究发现，RLM可抑制DOX引发的caspase-3激活，而HO-1抑制剂SnPP处理后，caspase-3活性再次增高，这表明HO-1能在一定程度上削弱DOX的促凋亡效应，最终抑制DOX引起的心肌细胞凋亡、坏死及心肌纤维化。

综上所述，本研究认为RLM可以促进Nrf2核转位，从而诱导心肌组织内HO-1表达上调，增强其酶活性，进而通过HO-1对DOX导致的心肌细胞凋亡产生抑制作用。

参考文献：

[1]Du B,An Y,Kang Y,et al.Characteristics of critically ill patients in ICUs in Mainland China[J].Crit Care Med,2013,41(1):84.

[2]Shih CM,Cheng SN,Wong CS,et al.Antiinflammatory and antihyperalgesic activity of C-phycocyanin[J].Anesth Analg,2009,108(4):1303.

[3]Cherng SC,Cheng SN,Tarn A,et al.Anti-inflammatory activity of c-phycocyanin in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages[J].Life Sci,2007,81(19-20):1431.

[4]Deshane J,Chen S,Caballero S,et al.Stromal cell-derived factor 1 promotes angiogenesis via a heme oxygenase 1-dependent mechanism[J].J Exp Med,2007,204(3):605.

[5]Zhang Z,Cui W,Li G,et al.Baicalein protects against 6-OHDA-induced neurotoxicity through activation of Keap1/Nrf2/HO-1 and involving PKCalpha and PI3K/AKT signaling pathways[J].J Agric Food Chem,2012,60(33):8171.

[6]Sarady-Andrews JK,Liu F,Gallo D,et al.Biliverdin administration protects against endotoxin-induced acute lung injury in rats[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2005,289(6):L1131.

[7]Perl M,Hohmann C,Denk S,et al.Role of activated neutrophils in chest trauma-induced septic acute lung injury[J].Shock,2012,38(1):98.

[8]Lomas-Neira J,Perl M,Venet F,et al.The role and source of tumor necrosis factor-alpha in hemorrhage-induced priming for septic lung injury[J].Shock,2012,37(6):611.

[9]Carnesecchi S,Pache JC,Barazzone-Argiroffo C.NOX enzymes:potential target for the treatment of acute lung injury[J].Cell Mol Life Sci,2012,69(14):2373.

[10]Wang L,Taneja R,Razavi HM,et al.Specific role of neutrophil inducible nitric oxide synthase in murine sepsis-induced lung injury in vivo[J].Shock,2012,37(5):539.

[11]Kwon DJ,Ju SM,Youn GS,et al.Suppression of iNOS and COX-2 expression by flavokawain A via blockade of NF-kappaB and AP-1 activation in RAW 264.7 macrophages[J].Food Chem Toxicol,2013,58:479.

[12]Chung SW,Liu X,Macias AA,et al.Heme oxygenase-1-derived carbon monoxide enhances the host defense response to microbial sepsis in mice[J].J Clin Invest,2008,118(1):239.