潘灵锋,赵双双

(湖北师范学院 生命科学学院， 湖北 黄石 435002)

家蝇幼虫抗菌物质的诱导及抗菌活性研究

潘灵锋,赵双双

(湖北师范学院 生命科学学院， 湖北 黄石 435002)

针刺家蝇三龄幼虫诱导其体内产生抗菌物质，利用乙酸铵和硫酸铵盐析方法提取纯化家蝇三龄幼虫体内产生的抗菌物质，并进行抗菌实验，通过测量其抑菌圈的大小来确定其抑菌能力的强弱。实验结果显示：家蝇三龄幼虫经针刺诱导后能产生抗菌物质; 经初步鉴定该抗菌物质为蛋白质或多肽，且具有热稳定性。

家蝇幼虫；针刺；抗菌物质；抑菌圈

家蝇(Musca domestica)隶属昆虫纲、双翅目、环裂亚目、家蝇科,其种类繁多，对人类的危害主要是传播疾病。研究发现家蝇能携带 60多种细菌，一只家蝇的体表可沾有百万个细菌，最多的可携带五亿左右个细菌[1～3]。科学家研究发现，家蝇其体表及腹中携带数以万计的细菌、病毒以及寄生虫卵，但不得病，其原因可能在于家蝇体内能产生多种抗病菌和抗病毒的有效物质[4，5]。本文是以家蝇3龄幼虫为原材料，采用针刺损伤法诱导，除使原有抗菌蛋白的表达获得增强外，还激活了新蛋白的产生，这种新蛋白可能也具有抗菌活性。针刺诱导后利用乙酸铵对家蝇3龄幼虫体内产生的抗菌物质进行提取，并利用提取物作用于细菌培养物，通过测量其抑菌圈的大小来确定其抑菌能力的强弱[6～8]。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1 家蝇幼虫 采集自野外，经诱集饲料(配方：95%玉米粉 +5%酵母粉，用水拌湿)诱集家蝇产卵，卵孵化后于实验室饲养，产生3龄幼虫。

1.1.2 供试微生物 革兰氏阴性菌：大肠杆菌，革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(来源于湖北师范学院生命科学学院)。

1.1.3 试剂及溶液 蔗糖、氯化钠、蛋白胨、酵母提取物、氢氧化钠、硫酸铵、硫酸铜、乙酸铵。

1)家蝇幼虫体内抗菌物质提取剂 乙酸铵缓冲液(0.05、0.1、0.2、0.5mol/L)、0.9%的生理盐水、乙酸铵缓冲液与0.9%的生理盐水混合液(1∶1).

2)家蝇幼虫体内抗菌物质纯化剂 饱和硫酸铵溶液。

3)家蝇幼虫体内抗菌物质成分鉴定试剂 10%NaOH溶液、1%CuSO4溶液。

1.1.4 培养基 LB(Luria．Bertani)液体培养基、LB(Luria．Benani)固体培养基、PDA固体培养基、麸皮培养基。

1.2方法

1.2.1 家蝇3龄幼虫的免疫诱导

1)诱导剂的制备：各取等体积的扩培后的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌液5mL，4，000转/min，离心5min，弃上清液后，加入1mL的0.9%无菌生理盐水重新悬浮沉淀，作为诱导剂，4 ℃保存备用。

2)家蝇幼虫的针刺诱导：取家蝇3龄幼虫，75%酒精体表消毒后，用蘸取诱导剂的针刺其腹部，将其放置在饲养室内饲养24h，喂食人工饲料(95%玉米粉 和5%酵母粉，并含有相应的诱导源，使其在有诱导源的环境下生长)。

1.2.2 家蝇幼虫抗菌物质的提取与纯化

1)家蝇幼虫抗菌物质的提取 称取一定量家蝇3龄幼虫利用蘸取诱导剂进行针刺，另取等量未经针刺诱导的家蝇3龄幼虫作为对照，蒸馏水清洗后干燥，分别放入4℃预冷的研钵中，按1∶5的比例(重量体积比)加入相应体积的4℃预冷提取缓冲液。冰浴上充分研磨成浆后，4，000转/min，离心5min，以去除血细胞和其它组织沉淀，收集上清，并在4℃下保存备用。

2)家蝇幼虫抗菌物质的纯化 利用0.2M的乙酸铵溶液对诱导后的家蝇3龄幼虫体内的抗菌物质进行提取(粗提取物)，再将获得的粗提物进行75℃加热处理， 10000转/min离心5min，收集上清，缓慢的向上清中加入饱和硫酸铵，搅拌混匀，使其硫酸铵的终浓度达到50%， 4℃冰箱中静置4 h，10000×g离心5min，取沉淀，再将沉淀溶于0.2M的乙酸铵缓冲液中， 4 ℃，透析袋 (8 000～ 15 000)透析过夜, 将透析好的粗提液4℃下保存备用。

1.2.3 家蝇幼虫产生抗菌物质的抗菌活性检测

采用滤纸片法：在平板上贴上1cm左右的无菌滤纸片，然后在滤纸片上点加待测抗菌物质粗提取液50μL，以同体积未经针刺诱导的家蝇3龄幼虫提取液作为阴性对照，室温下待样品完全扩散后，于37度培养箱中培养48h，观察并测量抑菌圈直径，并计算抑菌比(用来表明抗菌活性的强弱)。

1.2.4 家蝇幼虫免疫诱导后产生抗菌物质的初步鉴定

采用双缩脲反应方法检测：取一支试管，向试管中加入纯化后具有抗菌作用的粗提取液100μL，再滴加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液2滴，混匀，观察是否出现紫红色，以确定提取物纯化后，溶液中的主要成分为蛋白质。

2 结果

2.1家蝇幼虫免疫诱导后产生抗菌物质的抑菌活性的检测

对于利用蘸取诱导剂进行针刺诱导(处理)或未经针刺诱导(对照)的家蝇3龄幼虫提取液，利用滤纸片法检测其抑菌效果(见图1)。

图1A中：经针刺诱导家蝇幼虫的提取液对大肠杆菌(G-)的抑菌圈大小(直径)为13mm(滤纸片大小为11mm)，表明提取液中有抗菌物质产生；

图1B中：经针刺诱导家蝇幼虫的提取液对金黄色葡萄球菌(G+)的抑菌圈大小为17mm(滤纸片大小为11mm)，表明提取液中有抗菌物质产生；

图1C中：未经针刺诱导家蝇幼虫的提取液对大肠杆菌(G-)的抑菌圈大小为0mm，说明未经针刺诱导家蝇幼虫的提取液对大肠杆菌(G-)无抗菌效果，表明提取液中无抗菌物质产生；

图1D中：未经针刺诱导家蝇幼虫的提取液对金黄色葡萄球菌(G+)的抑菌圈大小为0mm，说明未经针刺诱导家蝇幼虫的提取液对金黄色葡萄球菌(G+)无抗菌效果，表明提取液中无抗菌物质产生。

滤纸片法抑菌试验结果显示家蝇幼虫经针刺免疫诱导后产生了抗菌物质，该抗菌物质对金黄色葡萄球菌(G+)的抑菌效果比对大肠杆菌(G-)的抑菌效果好。抑菌效果可用抑菌比(抑菌圈的大小/滤纸片大小)来表示(见表1)。

图1 家蝇幼虫针刺诱导/未针刺诱导提取液的抑菌效果

A：针刺诱导家蝇幼虫的提取液对大肠杆菌(G-)的抑菌效果；

B：针刺诱导家蝇幼虫的提取液对金黄色葡萄球菌(G+)的抑菌效果；

C：未经针刺诱导家蝇幼虫的提取液对大肠杆菌(G-)的抑菌效果；

D：未经针刺诱导家蝇幼虫的提取液对金黄色葡萄球菌(G+)的抑菌效果。

表1 家蝇幼虫针刺诱导/未经针刺诱导提取液的抑菌效果(抑菌比)

2.2家蝇幼虫免疫诱导后产生抗菌物质的初步鉴定

家蝇幼虫经免疫诱导后的提取液进行双缩脲反应，试管中加入纯化后的粗提取液，再滴加NaOH溶液后没有任何现象产生，当加入CuSO4溶液后，上层略显蓝色，下层清澈，当混匀后，可以观察到溶液由蓝色变成紫红色，其结果表明家蝇幼虫经免疫诱导后的提取液纯化后，溶液中的主要抗菌成分初步鉴定为蛋白质或多肽。

3 分析

1)家蝇3龄幼虫体内的抗菌物质是在针刺诱导的情况下才大量的表达，该抗菌物质经初步鉴定其主要成分为蛋白质或多肽，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有良好的抗菌作用；

2)本研究以家蝇3龄幼虫为原材料，利用诱导剂进行针刺诱导，使其体内抗菌基因表达，产出抗菌物质，该抗菌提取物经75℃加热5min处理后，仍然保持良好的抑菌活性，表明家蝇体内的抑菌物质具有较强的耐热性；

3)该抗菌物质经初步鉴定其主要成分为蛋白质或多肽，还需通过阳离子交换层析、亲和层析进一步纯化，通过SDS-PAGE进行相对分子质量的测定，利用IEF-PAGE进行等电点的测定以及凝血活性检测是否有凝血反应等性质，对具有抗菌活性的蛋白质或多肽进行进一步鉴定，为广谱抗菌新药开发打下基础。

[1]屈军梅，黄庭汝，屈孝初，等. 家蝇抗菌肽的分离纯化及生物学活性[J].中国兽医学报，2007，27(3) : 387～389.

[2]钟 雅，付 康，陈正望，等. 一个家蝇抗菌肽的分离纯化[J]. 华中农业大学学报，2007 , 26(5) : 727～729.

[3]赵瑞君，刘成芳，董建臻，等. 家蝇抗菌肽的诱导提取及筛选[J]. 热带医学杂志，2005， 5(2) :193～194.

[4]陈留存，王金星，刘 瑶，等. 家蝇抗菌肽的分离纯化及性质研究[J]. 山东大学学报(自然科学版)，2001，36(3) : 351～356.

[5]罗金香，杨春龙，吴伟东. 家蝇抗菌肽的研究与应用[J]. 昆虫知识, 2005， 42(3) :236～239.

[6]周义文，尹一兵，涂植光，等. 家蝇抗菌肽抗菌活性及抗菌机制的初步研究[J].中国抗生素杂志，2004，29(5)：272～274.

[7]陆 婕， 钟 雅， 柳 林，等. 家蝇蛆抗菌肽提取工艺研究[J].昆虫学报， 2007, 50(2): 106～112.

[8]黎观红，洪智敏，贾永杰，等. 抗菌肽的抗菌作用及其机制[J]. 动物营养学报， 2011， 23(4): 546～555.

Keywords: the third instar of housefly；acupuncture；antibiotic substance；inhibition zone

ThestudyfortheinducementofantibacterialsubstancesandtheirantibacterialactivityinMuscadomesticalarvae

PAN Ling-feng , ZHAO Shuang-shuang

(College of Life Sciences, Hubei Normal University, Huangshi 435002,China)

This paper explored the antibiotic substance induced by acupuncture on the third instar of housefly. The method of ammonium acetate and ammonium sulfate was used for purifying the antibiotic substance which produce by the third instar, and antibacterial experiment was conducted after the purification. The bacteriostatic ability was measured by the size of the inhibition zone. The results showed that the antibiotic substance was produced after the induction of acupuncture, and the chemical nature of the antibiotic substance was protein or polypeptides via the preliminary identification.

2014—01—10

潘灵锋(1991— )，男，湖北黄石人.

Q93

A

1009-2714(2014)02- 0074- 04

10.3969/j.issn.1009-2714.2014.02.017