尹静静等

摘要：本研究分析了水稻野生型和phyB突变体中脯氨酸代谢途径关键基因的表达水平。结果显示，干旱处理能够诱导脯氨酸生物合成相关基因OsP5CS1和OsOAT的表达，抑制脯氨酸生物降解基因OsP5CDH的表达。且phyB突变体中OsP5CS1基因的表达水平明显高于野生型，据此推测phyB负调控OsP5CS1基因的表达。为了分析OsP5CS1基因的高水平表达是否与phyB突变体较强的干旱胁迫耐性有关，本研究进一步培育了转OsP5CS1基因烟草。离体叶片失水速率结果表明，转基因烟草的失水速率小于野生型；盐胁迫条件下，转基因烟草的分化率明显高于野生型。综上所述，phyB对脯氨酸代谢途径的调控是phyB突变体具有较强干旱胁迫耐性的重要因素之一。

关键词：水稻；phyB突变体；脯氨酸；干旱；盐胁迫

中图分类号：Q786：Q945.79 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）03-0001-04

AbstractThe expression levels of key genes involved in proline metabolic pathway were compared in rice wild type （WT） and phyB mutant. The results showed that dehydration treatment induced the expression of proline biosynthetic gene OsP5CS1 and OsOAT， but suppressed the expression of proline catabolic gene OsP5CDH. And the expression level of OsP5CS1 gene in phyB mutant was obviously higher than that in WT， which suggesting that phyB negatively regulated its expression. To explore the relation between high OsP5CS1 transcript level and stronger drought tolerance in phyB mutant， the OsP5CS1 transgenic tobacco was obtained. Water loss rate assays of detached leaves revealed that transgenic tobacco showed a slower water loss rate compared to non-transgenic tobacco. In addition， the leaf disk differentiation rate under high salinity of transgenic tobacco was higher than that of non-transgenic tobacco. These findings suggested that the regulation of phyB on proline metabolic pathway was one of the important factors contributing to stronger drought tolerance in phyB mutant.

Key wordsRice； phyB mutant； Proline； Drought； Salt stress

植物受到非生物胁迫后，能够诱导许多基因的表达，其中一类基因编码参与渗透调节物质合成和解毒作用的酶及转运蛋白[1]。脯氨酸是一种重要的渗透调节物质，其在植物中的主要作用可分为两部分：一是保持原生质与环境的渗透平衡[2]，它可与胞内一些化合物形成聚合物，类似亲水胶体，防止水分散失；二是保持膜结构的完整性[3]。脯氨酸与蛋白质相互作用能增加蛋白质的可溶性，减少可溶性蛋白的沉淀，增强蛋白质的水合作用。

植物体脯氨酸的合成有两条途径：谷氨酸途径和鸟氨酸途径[4]。谷氨酸途径的初始底物是谷氨酸，在吡咯琳-5-羧酸合成酶[P5CS，Delta（1）-pyrroline-5-carboxylate synthetase]的催化下生成谷氨酸半醛（GSA），GSA在吡咯琳-5-羧酸还原酶 （P5CR）的催化下生成脯氨酸。研究表明，P5CS是脯氨酸合成途径中起主要调控作用的关键酶[4]，是整个反应的限速酶并受脯氨酸的反馈抑制[5]。吡咯琳-5-羧酸脱氢酶[P5CDH，Delta（1）-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase]催化GSA生成谷氨酸，参与脯氨酸的降解途径。鸟氨酸途径的底物是鸟氨酸，在鸟氨酸转氨酶（OAT，Ornithine-δ-aminotransferase）的催化下生成GSA，从而参与脯氨酸的合成。在渗透胁迫和氮饥饿情况下，脯氨酸经由谷氨酸途径合成占主导。

已有的研究表明，水稻光敏色素B（phyB）突变体具有较强的干旱胁迫耐性，生理机理分析结果表明，其具有较强的渗透调节能力，干旱条件下phyB突变体中脯氨酸含量高于野生型[6]。据此推测phyB影响脯氨酸代谢。为了分析phyB影响脯氨酸代谢及干旱胁迫耐性的机制，本研究比较了正常及干旱处理条件下野生型和phyB突变体中脯氨酸代谢相关基因的表达水平。此外，构建了OsP5CS1基因的过表达载体，获得了转基因烟草，并对其干旱和盐胁迫耐性进行分析。

1材料与方法

1.1植物材料

本研究所用水稻材料（野生型和phyB突变体）为日本晴（Oryza sativa L. cv. Nipponbare）[7]，所用烟草品种为SR（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR）。

1.2水稻的干旱处理

野生型和phyB突变体水稻种子表面消毒后，播种于0.4%（W/V）的琼脂培养基中，光照培养箱（宁波江南）中培养7 d后，移栽至温室 （光照14 h，28℃；黑暗10 h，23℃） 土壤中继续培养至六叶一心期。取第五叶在光照培养箱中（相对湿度60%，25℃，4 900 lx）失水处理4 h，取材保存于液氮中，用于分析脯氨酸代谢相关基因的表达模式。

1.3基因表达模式分析

按照RNAiso Plus（TaKaRa）说明书提取水稻RNA。利用RNase-free DNase（TaKaRa）除去RNA中的DNA，根据PrimeScript RT Enzyme Mix I（TaKaRa）说明书合成第一链。本研究所用基因在GenBank数据库中的序列号、引物序列及扩增条件如表1所示。以ACTIN为内参基因。引物由上海英潍捷基生物有限公司合成。

2结果与分析

2.1干旱处理后水稻脯氨酸代谢相关基因表达模式分析

如图1所示，正常条件下，OsP5CS1、OsP5CDH和OsOAT基因在野生型和phyB突变体中的表达水平无显著差别。干旱处理4 h后，OsP5CS1基因在野生型中的表达略有提高，但在phyB突变体中的表达明显提高。OsP5CDH基因的表达受干旱处理的抑制，且在phyB突变体中的抑制效果更明显。干旱处理同样诱导了OsOAT基因在野生型和phyB突变体中的表达。这些结果表明，干旱处理诱导脯氨酸合成途径相关基因的表达，抑制降解途径相关基因的表达，且phyB负调控干旱处理对OsP5CS1基因的诱导。

3讨论

在本研究中，干旱胁迫诱导了脯氨酸合成基因OsP5CS1和OsOAT的表达，抑制了降解基因OsP5CDH的表达。这与已有的报道一致，OsP5CS1和OsOAT基因被干旱、高盐等胁迫因素诱导[12，13]。关于干旱对OsP5CDH基因表达调控的研究尚未见报道。通过比较野生型和phyB突变体中脯氨酸代谢相关基因的表达水平，可以看出phyB负调控干旱对OsP5CS1基因的表达。phyB是水稻光敏色素家族成员，主要感受红光[7，14，15]。ABA是一种重要的植物激素，在调节植物渗透胁迫反应中具有重要作用。已有研究表明，phyB突变体中ABA的含量以及ABA敏感性均高于野生型[16]。因此，phyB可能通过影响ABA途径调控OsP5CS1基因的表达。除了ABA依赖途径，脯氨酸的积累还受ABA非依赖途径的调控[17]，水稻phyB是否参与调控脯氨酸ABA非依赖途径的累积还需要进一步研究。

通过分析OsP5CS1转基因烟草的干旱和盐胁迫耐性，初步发现过表达OsP5CS1基因能够降低转基因烟草离体叶片的失水速率并提高叶盘在盐胁迫下的分化能力，据此推测OsP5CS1转基因烟草具有较强的干旱胁迫和盐胁迫耐性。因此，干旱处理后phyB突变体中OsP5CS1基因表达水平较高可能是phyB突变体具有较强干旱胁迫耐性的因素之一。

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