袁 伟，方 杰，瓦庆彪，陈前明

(1.遵义医学院附属医院 皮肤科，贵州 遵义 563099；2.成都市第二人民医院 皮肤科，四川 成都 610017)

端粒酶活性增强可导致细胞永生化、肿瘤形成。内源性端粒酶抑制基因PinX1(PIN2/TERF1 interacting, telomerase inhibitor 1)基因是在人类细胞中发现的一个能与端粒酶逆转录酶hTERT(human telomerase reverse transcriptase)直接相互作用的端粒酶/端粒调控因子，能下调端粒酶活性，缩短端粒长度，进而诱导肿瘤细胞凋亡，被推测为潜在的抑癌基因。目前已发现PinX1在人类包括肝癌、膀胱癌、肺癌、鼻咽癌、食管癌等多种肿瘤中的表达明显降低或无表达[1-3]，而且在皮肤肿瘤中已有研究表明端粒酶活性高于正常皮肤组织[4]。本研究旨在通过检测PinX1、hTERT在基底细胞癌(basal cell carcinomas，BCC)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)中的表达，探讨PinX1、hTERT在BCC、SCC发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 标本资料 实时定量PCR应用新鲜组织标本，采集2012年3月至2013年3月遵义医学院附属医院及成都第二人民医院手术标本，包括BCC13例(男5例，女8例，年龄40～88岁，平均56.85±15.07岁)、SCC22例(男10例，女12例，年龄51～93岁，平均68.68±12.67岁)及正常皮肤组织15例(男性9例，女性6例，年龄22～65岁，平均39.66±11.85岁)。取材部位：头、面、四肢、躯干。所有标本采集离体10 min内置入冻存管内，放入-80 ℃低温冰箱保存。免疫组化石蜡标本为遵义医学院附属医院及成都市第二人民医院2008年12月至2012年6月明确诊断的病变组织石蜡标本。取材部位：头、面、四肢、躯干。其中30例BCC(男11例，女19例，年龄40～84岁，平均65.33±11.91岁)、46例SCC(男21例，女25例，年龄41～95岁，平均66.63±11.99岁)及正常皮肤组织17例(男8例，女9例，年龄15～60岁，平均38.54±14.12岁)。研究对象选择标准如下：①基底细胞癌及鳞状细胞癌均有典型或较为典型的皮损，术前均未经放疗、光动力治疗以及其它特殊治疗，经皮肤病理检查证实具有其相应的典型病理改变；②对照组正常皮肤为接受美容或整形外科手术的个体，均无免疫性疾病和系统性疾病。

1.2 主要实验试剂 实时定量PCR主要试剂：逆转录反应体系试剂盒(大连TakaPa公司)、SYBR Green I嵌合荧光法试剂盒(大连TakaPa公司)、PinX1与hTERT引物及内参还原磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物均由上海Sangon公司设计合成，引物序列(见表1)。免疫组化主要试剂：兔抗人PinX1多克隆抗体(美国Assay生物公司)、兔抗人TERT多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)、PV-9000免疫组化染色试剂盒 (北京中杉金桥生物公司)、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物公司)。PinX1多克隆抗体工作液浓度为1∶75，hTERT多克隆抗体工作液浓度为1∶200。

表1 PinX1、hTERT及GAPDH引物序列

基因引物长度PinX1Forward: 5'-GGTGGTCTAAAG-GAAAGGGTTT-3'Reverse: 5'-ATGGGCAATCCAGTTGTCTT-3'127hTERTForward: 5'-CTCCCATTTCATCAGCAAGTTT-3'Reverse: 5'-CTTGGCTTTCAGGATGGAGTAG-3'96GAPDHForward: 5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'Reverse: 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'258

1.3 实验方法

1.3.1 实时荧光定量PCR ①提取总RNA，合成cDNA：取组织100 mg采用Trizol一步法提取组织内总RNA。所提取的总RNA用紫外分光光度计测定A260/A280含量并检测其纯度，1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。筛选所有比值在1.8～2.0且无降解的样品，取2 μg总RNA按逆转录反应体系试剂盒说明合成cDNA。cDNA放入-20 ℃冰箱中保存备用。②扩增及电泳：以cDNA为模板，利用Bio-RAD荧光定量PCR仪(美国Bio-RAD公司)按照SYBR Green I嵌合荧光法试剂盒说明书检测PinX1、hTERT基因mRNA在基底细胞癌、鳞状细胞癌及正常皮肤组织中的表达。扩增反应条件：PinX1 PCR：预变性95 ℃10 s，1个循环：变性95 ℃10 s，退火(复性)55 ℃30 s，40个循环；GAPDH PCR：预变性95 ℃10 s，1个循环；变性95 ℃10 s，退火60 ℃30 s，40个循环；hTERT PCR：预变性95 ℃10 s，1个循环；变性95 ℃10 s，退火60 ℃30 s，40个循环。采用2-△△ct法对有特异性扩增的目的基因进行相对定量。反应结束后分析PCR扩增曲线及熔解曲线，并进行2%琼脂糖凝胶电泳实验检测扩增特异性。

1.3.2 免疫组化 石蜡标本4 μm连续切片。采用免疫组化SP法，行pH6.0柠檬酸盐缓冲液高压修复抗原，具体方法参照试剂盒说明书进行。DAB显色，苏木精复染。PBS代替一抗作为阴性对照。PinX1免疫组化结果以胞核内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性；hTERT免疫组化结果以胞核或(和)胞浆内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。染色范围以免疫染色最多的区域，每个标本在400倍图像下等距随机选10个视野，按一定顺序计数500个细胞，计算阳性细胞率并评分：基本无染色为0分，浅棕黄色为1分，棕色为2分，棕褐色为3分；着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分，6%～30%为1分，3l%～60%为2分，>61%为3分。评分=着色程度得分×着色细胞百分率得分。<2分为阴性(-)，≥2分为阳性(+)[5]。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，对实时定量PCR各组数据进行单因素方差分析；免疫组化实验组与对照组之间阳性表达率比较采用2检验进行比较分析，两样本相关性分析用Spearman相关检验，以α=0.05为检验标准。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR结果

2.1.1 总RNA纯度和完整性 A260/A280样本比值在1.8～2.0，提示总RNA纯度良好；在紫外线灯下可见28S、18S和5S三条大小和比例合适的条带，表明提取的总RNA无降解。

2.1.2 PinX1及hTERT mRNA的表达水平 PinX1基因PCR扩增产物电泳图在127bp处可见明显的电泳条带，hTERT基因PCR扩增产物电泳图在96 bp处可见明显的电泳条带，GAPDH基因PCR扩增产物电泳图在258bp处可见明显的电泳条带(见图1)。

注：M为DNA Marker 2000；1、2、3为PinX1扩增片断(127bp)；4、5、6为GAPDH扩增片断(258bp)；7、8、9为hTERT扩增片断(96bp)。 图1 PinX1、GAPDH和hTERT电泳图

2.1.3 PinX1及hTERT基因mRNA的相对表达量 BCC、SCC组织中PinX1 mRNA的相对表达量均低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，BCC与SCC组织中PinX1 mRNA的相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)；BCC、SCC组织中hTERT mRNA的相对表达量均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，BCC与SCC组织中hTERT mRNA的相对表达量差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

组别例数PinX1hTERTBCC132.26±1.38*5.90±2.94*SCC222.68±1.71*6.28±4.01*Control154.25±2.021.62±0.99

注：*：与对照组相比，P<0.05。

2.2 免疫组化结果

2.2.1 BCC、SCC组织中PinX1蛋白的表达 PinX1蛋白阳性产物主要定位于胞核，SP染色呈粗细不一的棕黄色颗粒。正常皮肤组织中PinX1蛋白呈阳性表达(见图2A)。基底细胞癌、鳞状细胞癌中，可见到PinX1蛋白呈不同程度的表达(见图2B、2C)。两组PinX1阳性表达率均明显低于正常组织，差异有统计学意义(基底细胞癌与鳞状细胞癌组织PinX1阳性表达率差异无统计学意义(2=0.241，P>0.05,见表3)。

表3 PinX1蛋白在皮肤肿瘤组织和正常皮肤组织中的表达

组别例数PinX12PBCC306(20.0)9.3930.002SCC466(13.04)14.2950.000Nor-mal1711(64.7)

注：A：PinX1蛋白在正常皮肤组织中的表达；B：PinX1蛋白在BCC组织中的表达；C：PinX1蛋白在SCC组织中的表达；D：hTERT蛋白在正常皮肤组织中的表达；E：hTERT蛋白在BCC组织中的表达；F：hTERT蛋白在SCC组织中的表达。 图2 PinX1、hTERT蛋白在各组组织中的表达(SP ×100)

2.2.2 BCC、SCC组织中hTERT蛋白的表达 hTERT蛋白阳性产物主要定位于细胞核或(和)细胞浆中，SP染色呈棕黄色颗粒。正常组织中多数hTERT表达呈阴性(见图2D)。基底细胞癌、鳞状细胞癌中，hTERT蛋白均有表达(见图2E、2F)，其阳性表达率均明显高于正常组织，差异有统计学意义(基底细胞癌、鳞状细胞癌之间hTERT蛋白阳性表达率差异均无统计学意义(2=0.163，P>0.05,见表4)。

表4 hTERT在皮肤肿瘤组织和正常皮肤组织中的表达

组别例数hTERT2PBCC3019(63.3)11.6750.001SCC4627(58.7)11.0050.001Nor-mal172(11.8)

2.2.3 PinX1与hTERT蛋白表达的相关性分析 通过对PinX1与hTERT蛋白在组织中的阳性表达及阴性表达例数进行Spearman等级相关分析，结果表明：基底细胞癌组织中二者表达呈负相关(r=-0.439，P<0.05)；鳞状细胞癌组织中二者表达呈负相关(r=-0.476，P<0.05)；基底细胞癌及鳞状细胞癌两种皮肤肿瘤中二者表达呈负相关(r=-0.460，P<0.05)。

3 讨论

端粒酶能以自身RNA为模板合成端粒DNA，并加至端粒末端以维持端粒长度的稳定，抵消因各种原因造成的端粒的缩短及不稳定。正常人体细胞端粒酶活性缺乏，细胞分裂同时端粒就会相应缩短，当端粒缩短到一定长度时，保护染色体末端的功能丧失，最终导致细胞衰老或凋亡；而在肿瘤细胞中，端粒酶被重新活化，使端粒长度稳定，细胞因此逃过死亡而无限增殖，导致肿瘤细胞永生化[6-8]。

人端粒酶的主要组成为：①人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT);②端粒酶相关蛋白(telomerase associated protein, TP);③人端粒酶RNA(human telomerase RNA，hTR)。在端粒酶的活性起调控中，端粒酶催化亚单位TERT最为重要，是关键的限速酶，而端粒RNA及端粒酶相关蛋白均不能决定端粒酶活性[9]。hTERT为RNA依赖的DNA 聚合酶，可识别单链富含G的寡核苷酸引物，以其RNA组分的碱基为模板与端粒重复序列进行碱基互补配对，在合成、延伸碱基序列中起催化作用[10]。

作为内源性端粒酶抑制基因，PinX1基因由7个外显子组成，有两种转录形式，分别编码174个氨基酸和328个氨基酸[11]。其定位于8p23，该区域同时也是一个在多种人类肿瘤中发生高频杂合缺失(loss of heterozygosity，LOH) 的区域。有体外实验证据表明，PinX1与其端粒酶抑制结构域TID可以与hTERT相互作用，下调端粒酶活性[11-12]。同时，PinX1还可依赖TERT结合端粒酶的RNA组分，阻断端粒酶RNA，从而使其丧失活性，破坏其模板功能，从而抑制端粒酶活性[13-14]。

PinX1在正常人体组织内广泛存在，而在肿瘤组织中则低表达或者不表达[11]；hTERT在肿瘤组织中存在高表达，而在正常组织中低表达或不表达[15]。本实验结果显示PinX1在基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌组织中的表达水平明显低于正常组(P<0.05)，部分低表达或不表达，提示作为内源性端粒酶抑制基因，PinX1可能参与皮肤组织细胞端粒酶活性的下调，维持细胞的正常凋亡，抑制肿瘤的生长，由于PinX1的损伤或缺失，端粒酶在基底细胞癌、鳞状细胞癌组织中活化，使细胞永生化肿瘤生长。hTERT在基底细胞癌、鳞状细胞癌组织中的表达水平明显高于正常组(P<0.05)，hTERT作为端粒酶的活性调控关键的限速酶，其在基底细胞癌、鳞状细胞癌组织中呈高表达，提示端粒酶活性在基底细胞癌、鳞状细胞癌及日光性角化病组织中可能强于正常皮肤组织，hTERT的高表达可能促进基底细胞癌、鳞状细胞癌的发生。基底细胞癌、鳞状细胞癌组织中PinX1表达和hTERT 表达呈负相关，推测二者可能存在着一定的拮抗，可能因为PinX1下调，hTERT不能被有效结合并抑制，致使端粒酶活性增强，端粒长度得到维持，因此细胞不能正常衰老或凋亡而无限增殖，从而导致肿瘤生长。

综上所述，检测PinX1和hTERT的表达可能对评价基底细胞癌、鳞状细胞癌的发展有重要的临床价值，PinX1、hTERT有可能成为基底细胞癌、鳞状细胞癌新的检测指标，而且通过调控PinX1、hTERT的表达可能成为治疗基底细胞癌、鳞状细胞癌的一条新途径。

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