高 倩，李 蔓，张万山，魏守刚

(1.首都医科大学公共卫生学院儿少卫生与妇幼保健学系，北京 100069；2.首都医科大学，环境毒理学北京市重点实验室，北京 100069)

肥胖症已成为世界范围内危害人体健康、影响生命质量、增加社会医疗负担的现代流行性疾病[1]。铁是人体一种必需微量元素，铁缺乏可造成免疫损伤，运动能力下降等危害。近年来的许多研究发现，肥胖患者比正常体重人群更易发生铁缺乏[2]。肥胖与铁缺乏集于一身，将对机体带来双重危害，严重影响人体尤其是儿童的健康。一些研究表明，肥胖儿童铁的需要量并无增加，膳食铁的摄入量和生物利用度也不低[3]，肥胖儿童对稳定性同位素示踪铁的膳食吸收率显著低于正常对照儿童[4]，提示我们膳食铁吸收不良是导致肥胖性铁缺乏发生的原因。十二指肠是铁吸收的主要部位，十二指肠中有两种主要铁吸收分子即二价金属离子转运体(divalent metal transporter 1,DMT1)和膜铁转运蛋白(ferroportin 1,FPN1)对铁的吸收发挥起直接调控作用。目前国内外有关肥胖对肠铁吸收影响机制的研究较少，相关铁吸收分子在肥胖机体内如何调节铁的吸收尚不清楚。因此本实验以高脂膳食建立小鼠肥胖模型，采用实时荧光定量PCR和Western blot法分析营养性肥胖对小鼠十二指肠DMT1、FPN1mRNA及蛋白表达的影响，初步探讨肥胖影响铁吸收的机制，为今后有效预防和治疗肥胖性铁缺乏提供理论和实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物分组及处理

4周龄雌性C57BL/6J小鼠12只，体重10～13 g，由军事医学科学院实验动物中心提供【SCXK(军)2012-0004】。动物饲养于首都医科大学实验动物中心【SYXK(京)2010-0022】。以普通饲料适应性喂养1周后，将小鼠随机分为2组，即正常对照组和肥胖模型组，每组6只。对照组小鼠继续饲以普通饲料，模型组饲以经辐照消毒的特制高脂鼠料，配方为基础饲料79%、猪油10%、蛋黄粉10%、胆固醇1%(军事医学科学院实验动物中心提供)，饲养期14周，每周测体重1次。

饲养建模结束后，用10%水合氯醛按400 mg/kg体重腹腔注射麻醉小鼠，开腹剪取十二指肠，液氮中速冻保存，用于后续实验检测。

动物饲养及实验符合《实验动物管理条例》，并经首都医科大学伦理委员会许可。

1.2 实时荧光定量PCR法检测DMT1、FPN1 mRNA含量

取冻存十二指肠组织100 mg，Trizol法提取总RNA，用紫外分光光度计测量260 nm、280 nm波长处的吸光度值，计算A260/A280和RNA浓度。取5 μL RNA进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测RNA的完整性。参照DNase Ⅰ试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)对RNA中残留的基因组DNA进行消化处理，在2 μg总RNA样本中加入DNase I 2 μL，10×缓冲液2 μL，无RNase水至20 μL，37℃孵育30 min后，加入2 μL 200 mmol/L EDTA终止反应，65℃孵育10 min。处理后的总RNA样品用HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒(北京康为)进行反转录，cDNA合成反应体系(20 μL)：2 μL Primer mix(Oligo dT引物，随机引物)，5×缓冲液4 μL，0.1 mmol/L DTT 2 μL，10 mmol/L dNTP 1μL，消化后的RNA 10 μL，200 μmol/L HiFi-MMLV 反转录酶1 μL，加无RNase水至20 μL。反应条件: 37℃孵育50 min，70℃孵育10 min。反应产物置于-20℃冰箱保存。

用荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)按照Ultra SYBR Mixture PCR 试剂盒(北京康为)进行扩增。目的基因和内参基因的引物序列如下：(1)DMTI 上游5′-GCGCTCTTTGTTTCCTTCAT-3′，下游5′-TTGTCACTGGGAAAGAGGTC-3′，扩增片段长度140 bp；(2)FPN1上游5′-CCCTTCCGC ACTTTCCGAAT-3′，下游5′- GAGAATAGACC AGTCCGAACAAGGC-3′，扩增片段长度257 bp；(3)β-actin上游5′-GCCTTCCTTCTTGGGTAT-3′，下游5′-GGCATAGAGGTCTTTACGG-3′，扩增片段长度97 bp。20 μL扩增反应体系包括: 2×Ultra SYBR Mixture 10 μL，0.4 μL上游引物10 μmol/L，0.4 μL下游引物10 μmol/L，2 μL cDNA 10 μmol/L，加入灭菌蒸馏水至20 μL。扩增程序为：95℃预变性10 min，(95℃ 15 s，60℃ 60 s)×45个循环。每个样品同时做3个重复。试验结果按照2-ΔΔCt相对定量公式计算即ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct内参基因)实验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组，将对照组小鼠mRNA表达水平定为1，分析模型组和对照组不同基因表达的差异。

1.3 Western blot法检测FPN1蛋白的表达

应用RIPA试剂提取组织蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白质采用12%SDS-PAGE凝胶电泳，转膜至NC膜，丽春红染膜。室温封闭(3%BSA，TBST稀释)30 min，然后加入兔抗FPN1多克隆抗体(英国Abcam公司，1∶2000)，4℃过夜。次日TBST洗膜后加入1:5000 辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(H+L)抗体(北京天德悦生物科技有限公司)，室温摇动孵育40 min。使用ECL试剂盒发光显影，胶片曝光。以GAPDH作为内参，相同实验重复3次。胶片曝光结果扫描输入计算机后，用TotalLab Quant凝胶成像分析软件分析处理，以目的蛋白与内参蛋白的积分光密度(integral optical density，IOD)比值表示相对表达水平。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 肥胖模型的构建情况

自喂养干预第3周，肥胖模型组小鼠体重增长量开始超出对照组，至第14周末，模型组和对照组小鼠平均体重分别为32.34±1.24 g和23.67±0.96 g，差异具有统计学意义。根据肥胖度计算公式计算模型组每只小鼠的肥胖度：肥胖度(%)=(模型组实际体重-对照组平均体重) /对照组平均体重×100，结果模型组所有小鼠体重均超过对照组小鼠平均体重的20%，其中体重最轻的小鼠肥胖度为28.43%，表明小鼠肥胖模型建立成功。模型组和对照组小鼠各周平均体重(表1)。

表1 不同组小鼠各周平均体重的情况(单位：g)

2.2 十二指肠DMT1、FPN1 mRNA表达水平

十二指肠样本中提取RNA的A260/A280均在1.9～2.1，说明提取的RNA纯度较高。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，图1可见28S、18S和5S rRNA 3条带，其中前两条带的相对亮度为2∶1，说明RNA完整性好，无明显降解。

注：A、B、C：对照组样本，D、E、F：模型组样本。

实时荧光定量PCR结果，目的基因DMT1、FPN1和内参基因β-actin的标准曲线线性良好，相关系数(R2)均大于0.997，扩增效率在99%～105%之间。融解曲线呈单峰，各基因均为特异性扩增。统计分析显示，与对照组相比，模型组小鼠DMT1、FPN1mRNA的相对表达水平均降低，差异具有统计学意义(P< 0.05)(图2)。

注：* 与对照组比较P < 0.05。

2.3 十二指肠FPN1蛋白的表达水平

Western blot检测结果见图3所示：模型组小鼠十二指肠FPN1蛋白表达水平低于对照组，其相对表达量分别为0.54±0.13和0.76±0.12，差异具有统计学意义(P< 0.05)。

注：* 与对照组比较P < 0.05。

3 讨论

肥胖动物模型是研究肥胖及其相关疾病的主要工具[5]，以与人类肥胖最为接近高脂饲料所致的单纯性肥胖模型应用最为广泛，由于C57BL/6J小鼠对高脂饮食较为敏感，国外很多肥胖相关的研究选用C57BL/6J小鼠进行[6-7]。因此，本研究选择C57BL/6J小鼠作为研究对象，采用饮食诱导方式建立肥胖模型，模型组小鼠平均体重高于对照组，差异具有统计学意义，证明成功构建肥胖小鼠模型。

肠铁吸收和释放主要依赖于肠上皮细胞的铁吸收蛋白的介导，食物中的三价铁离子首先被位于十二指肠刷状缘上的游离还原剂还原成二价铁离子，然后由位于刷状缘上的DMT1将其转运至肠上皮细胞的细胞质内，在上皮细胞内一部分铁以铁蛋白的形式储存在铁池内，另一部分铁被亚铁氧化酶氧化为高铁后,通过基底膜上的铁转运分子FPN1的介导，穿过上皮细胞的基底端细胞膜被运载出细胞,进入循环系统，满足机体对铁的需要。机体主要通过控制近端小肠的铁吸收量和铁释放量以达到铁稳态。肥胖状态下容易发生铁代谢紊乱，机体是通过怎样的途径如何调节小肠铁吸收蛋白的表达，肠铁吸收蛋白如何调节铁吸收，其具体调节机制目前还不甚清楚。

DMT1仅在哺乳动物小肠上皮细胞高度表达，其最主要的功能是对二价金属离子的摄取和转运，是介导膳食中非血红素铁从肠腔转入肠细胞的唯一铁转运体[8]。FPN1是一种跨膜的铁输出蛋白，主要位于十二指肠上皮细胞的基底部和基底侧膜，FPN1是铁离子释放的唯一出口，负责将细胞内的铁转运出细胞。本次实时荧光定量PCR实验结果显示，肥胖小鼠十二指肠上皮细胞的DMT1和FPN1表达水平低于正常小鼠表达水平。肥胖小鼠DMT1表达降低，说明摄入细胞内的铁量减少，FPN1表达降低，输出的铁量则会减少，表明肥胖小鼠转运铁的能力下降，肥胖导致小肠上皮细胞摄取及释放铁的能力发生障碍。一些利用高脂饲料喂养大鼠建立营养性肥胖模型的实验也得到了和本研究类似的结论，肥胖可使小肠上皮细胞DMT1mRNA表达降低[9]。许多因素参与DMT1mRNA表达的调控，例如：蛋白激酶C、TNF-α、IFN-γ、炎症介质、不同的发育阶段等。肥胖使小鼠十二指肠DMT1mRNA的表达降低，是肥胖引起上述因素调节DMT1mRNA的表达，还是肥胖状态直接作用于DMT1mRNA的表达，还需进一步研究。

Frazer等[10]研究发现，细胞基底膜FPN1表达水平仅受机体铁状况的影响，而不受肠腔内铁水平的影响；而DMT1表达水平明显依赖肠腔内铁含量的调节，这提示FPN1可能是决定肠铁吸收水平的关键性或限速性铁转运分子。目前研究发现，铁调素是一种肝脏分泌的负性铁调节因子，其可与FPN1结合，使FPN1内吞、降解，导致细胞内铁贮留，减少铁的输出。铁调素和FPN1蛋白表达呈负相关。本次Western blot实验发现，肥胖导致FPN1蛋白表达下降，推测可能与肥胖机体肝脏铁调素的表达增加有关，铁调素表达增加造成十二指肠FPN1蛋白表达减少，肠细胞输出的铁量降低，进而影响体内铁水平，这需要进一步的研究，为进一步阐明肥胖影响铁吸收的分子机制提供理论和实验基础。

综上所述，肥胖导致铁缺乏主要与负责十二指肠肠铁吸收的DMT1和FPN1两种蛋白表达密切相关。肥胖可致使十二指肠DMT1和FPN1表达下降，肠上皮细胞吸收和释放铁的能力减弱,造成机体不能满足对铁的需求，导致肥胖铁缺乏的发生。

参考文献：

[1] Teegarden D. Calcium intake and reduction in weight or fat mass[J]. J Nutr, 2003, 133(1): 249S-251S

[2] Nead KG, Halterman JS, Kaczorowski JM,etal. Overweight children and adolescents: a risk group for iron deficiency[J]. Pediatrics, 2004, 11(4):104-108.

[3] 王文媛,何怡峰,李晓华,等.147名单纯肥胖儿膳食调查[J].中国生育健康杂志，2003，14(4):240-241.

[4] Zimmermann MB, Zeder1 C, Muthayya S,etal. Adiposity in women and children from transition countries predicts decreased iron absorption, iron deficiency and a reduced response to iron fortification[J]. Int J Obes, 2008, 32(7):1098-1104.

[5] 汤锦花，严海东. 营养性肥胖大鼠模型的建立及评价[J].同济大学学报，2010，31(1):32-34.

[6] Halade GV, Rahman MM, Femandes G. Differential effects of conjugated linoleic acid isomers in insulin-resistant female C57BL/6J mice[J]. J Nutr Biochem, 2010, 21(4): 332-337.

[7] Henry M, Davidson L, Cohen Z,etal. Whole blood aggregation, coagulation, and markers of platelet activation in diet-induced diabetic C57BL/6J mice[J]. Diabetes Res Clin Pract.2009,84(1): 11-18.

[8] Shawki A, Mackenzie B. Interaction of calcium with the human divalent metal-ion transporter-1[J]. Biochem Biophys Res Commun,2010,393(3)：471-475.

[9] 冯荔.肥胖模型大鼠铁代谢和铁营养状态指标的检测及其意义[D].吉林大学, 2013.

[10] Frazer DM, Wilkins SJ, Becker EM,etal. A rapid decrease in the expression of DMT1 and Dcytb but not Lreg1 or hephaestin explains the mucosal block phenomenon of iron absorption[J].Gut, 2003,52(3):340-346.