石柔，雷又鸣，李会芳，宋滇平

论著·临床

肝脂酶基因启动子区-514C/T多态性与2型糖尿病 血脂代谢和胰岛素抵抗的相关性研究

石柔，雷又鸣，李会芳，宋滇平

目的探讨肝脂酶(HL)基因启动子区-514C/T多态性与2型糖尿病(DM) 血脂代谢和胰岛素抵抗(IR)的相关性。方法采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)结合DNA测序技术，对2型DM患者284例(DM组)和糖耐量正常的健康对照者197例(NC组)进行HL -514C/T多态性检测，并观察该基因多态性与血脂代谢、IR的相关性。结果(1)DM组患者C/C基因型和C/T+T/T基因型频率分别为39.2%和60.8%，等位基因C和T频率分别为64.5%和35.5%，NC组分别为32.7%、67.3%和63.2%、36.8%，2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)DM组中C/T+T/T基因型患者三酰甘油水平为(2.93±1.37)mmol/L, C/C基因型患者为(2.07±1.82)mmol/L，2组比较差异有统计学意义(P<0.05),余指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。(3)DM组中C/T+T/T基因型患者与C/C基因型患者IR相关指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。(4)Logistic回归分析表明，DM组中HL-514C/T基因多态性、BMI与TG异常呈正相关(OR=3.042，95%CI 1.265～7.317；OR=2.600，95%CI 1.520～4.447，P均<0.05)。结论HL-514C/T基因多态性可能与2型DM的发生无相关性，与2型DM患者IR亦无关，但是HL-514T等位基因可能是2型DM患者发生高TG血症的危险因素。

肝脂酶基因；糖尿病；血脂代谢；胰岛素抵抗；分子遗传学

脂代谢紊乱和胰岛素抵抗(IR)是2型糖尿病(DM)及其并发症的原发性病理生理过程。高脂血症既是IR的结果，也是IR的主要致病因素，二者互为因果[1]。肝脂酶(HL)是脂蛋白代谢的关键酶之一，其主要功能是参与高密度脂蛋白的重构和乳糜微粒残骸、低密度脂蛋白的代谢以及胆固醇的逆向转运。HL基因启动子区单核苷酸基因多态性与HL活性有关，并影响血脂谱。现探讨HL-514C/T多态性与2型DM血脂代谢及IR的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2011年3月—2012年11月于我院门诊就诊或住院2型DM患者284例(DM组)，均符合1999年WHO 2型DM诊断标准；排除标准：急性应激状态、严重肝脏及肾脏疾病、其他内分泌系统疾病等影响血脂代谢的疾病。284例中男146例，女138例，年龄37～75(61.1±10.7)岁，病程(3.6±3.1)年，其中有家族史者68例，无家族史者216例。患者均口服降糖药治疗且至少1个月内未使用调脂药。选择同期在我院体检糖耐量正常且无糖尿病家族史的健康者197例为健康对照组(NC组)，男102例，女95例，年龄32～72(59.4±11.6)岁。2组均为中国云南地区居住的无血缘关系的汉族人。2组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 观测方法

1.2.1 临床及生化指标检测： 记录2组对象的性别、年龄、病程、家族史等情况。测量身高、体质量、腰围、臀围并计算体质量指数(BMI)和腰臀比(WHR)。禁食12 h后次日晨采静脉血3 ml，全自动生化分析仪测定空腹血糖(FPG)及餐后2 h血糖(2hPG)、总胆固醇(TC)、三酰甘油 (TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，用微柱法测定糖化血红蛋白(HbA1c)。用放免法检测空腹胰岛素(FINS)水平，用稳态模型(HOMA)方法，计算胰岛素抵抗指数：HOMA-IR= (FPG×FINS)/22.5。

1.2.2 HL基因启动子-514C/T多态性分析： 用酚/氯仿法提取外周血白细胞DNA作为模版。以寡核苷酸5′-GGATCACCTCTCAATGGGTC-3′为上游引物，5′-GGAAATTCTGCCAAAGGTCGG-3′为下游引物(大连宝生物工程有限公司)进行PCR。PCR体系:DNA模板2 μl,10×Buffer(MgC12-Free) 5 μl, MgC12(25 mmol/L)4 μl，DNTP(2.5 mmol/L)1.2 μl，上下游引物(20 μmol/L)各1 μ1，Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.8 μl，加双蒸水至50 μl。PCR循环温度:95℃预变性5 min，然后按95℃变性45 s、60℃退火45 s、72℃延伸45 s的循环条件扩增，共35个循环，最后72℃延伸5 min。扩增产物以限制性内切酶Nla III(大连宝生物工程有限公司) 37℃酶切过夜。酶切产物经4 %的琼脂糖凝胶电泳及溴化乙锭染色后，观察结果。PCR产物纯化后交由大连宝生物工程有限公司进行DNA测序加以确证。

2 结 果

2.1 HL基因启动子- 514C /T基因型电泳图谱 扩增产物经限制性内切酶Nla III消化后，产生3种酶切结果：T/T基因型可见241bp的1条片段，C/T基因型可见306bp、241bp 2条片段，C/C基因型只有306bp 1条片段。见图1。

注：M.Marker；1、2、3.C/C基因型；4.C/T基因型；5.T/T基因型

2.2 扩增产物DNA测序结果 扩增产物片断为306bp，将产物测序并与GeneBank中HL基因启动子区-514位点C、T基因系列进行比较，与相应系列完全一致。见图2。

2.3 基因型频率和等位基因频率比较 对群体资料作Hardy-Weinberg平衡吻合度检验，符合Hardy-Weinberg平衡定律(P均>0.05)；NC组和DM组之间基因型和等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组HL基因型频率和等位基因频率

2.4 DM组中HL不同基因型间临床指标比较 DM组中C/T+T/T基因型与C/C基因型携带者相比TG升高(P<0.05)，其余指标差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 DM不同基因型间临床指标比较

注:与C/C基因型比较，aP<0.05

注：A.C/C型；B.C/T型；C.T/T型

2.5 DM组不同HL基因型间胰岛素抵抗相关指标比较 尽管C/T+T/T 基因型患者FINS、HOMA-IR 水平较C/C基因型患者高，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 DM不同基因型间胰岛素抵抗相关指标比较

2.6 Logistic回归分析 在DM组中以TG异常与否作为因变量(以TG ≥1.7 mmol/ L为异常)，以HL基因型、性别、年龄、BMI、WHR、FPG、2hPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、TC、HDL-C和LDL-C作为自变量，进行Logistic回归分析，结果提示：DM组中HL-514C/T基因多态性、BMI与TG异常呈正相关。见表4。

3 讨 论

在2型DM的发生、发展过程中常伴随着不同程度的脂代谢异常。人类肝脂酶是一种重要的脂肪酶，能水解各种脂蛋白内的三酰甘油和磷脂，释放出游离脂肪酸，在乳糜粒残骸的清除、LDL的形成及TC的逆向转运过程中起重要作用。不仅HL的合成和活性异常能引发血脂异常，而且HL基因启动子区域多态性也会影响其生理功能，从而影响脂代谢[2]。目前大部分的研究都集中在HL- 514C/ T多态性对脂代谢的影响上，而针对糖尿病及其相关危险因素的研究较少。

表4 Logistic回归分析结果

本研究提示在中国汉族人中HL-514位点存在3种基因型，即C/C型、C/T型和T/T型，T等位基因频率在DM组和NC组中分别为0.368和0.355。HL- 514C/T基因型及等位基因频率在DM组与NC组之间比较差异无统计学意义。提示HL-514C/T多态性与2型DM的发生无相关性，与大多数报道相一致[3，4]。

既往多项临床研究均表明HL- 514T等位基因与血浆HDL-C及TG的浓度增加有关[5，6]。最近国内外学者也报道在男性冠心病患者中，具有HL-514C/T和T/T基因型患者的HDL-C水平明显高于C/C组，提示该基因多态性与血脂的关系可能受性激素水平的影响[5，7]。与此同时来自美国的一项研究提出不同观点，他们发现在肥胖女性中HL-514C/T多态性独立影响HDL-C水平[6]。本研究发现在DM组中C/T+T/T基因型与C/C基因型携带者相比TG升高，但没有发现HL-514C/T多态性与HDL-C有关。研究结果的不同，分析其原因可能是HL-514C/T多态性与脂代谢的关系受种族、地域、生活方式、性别等多重因素的影响。Logistic回归分析显示：HL-514C/T基因多态性、BMI与TG异常呈正相关，提示 HL-514T等位基因可能是2型DM患者发生高TG血症的遗传危险因素。同时Logistic回归分析结果还显示超质量和肥胖可能是2型DM患者发生高TG血症的危险因素，这可能与肥胖引发IR，而IR又是2型DM和脂代谢紊乱发生的始动因素有关[8～12]。

由于脂代谢紊乱与IR密切相关，HL基因多态性与IR的关系也开始受到关注。Yasuyoshi等[13]在日本非糖尿病人群中发现，HL-514T等位基因携带者有较高水平的FINS和HOMA-IR。但本研究发现，在2型DM患者中，C/T+T/T 基因型患者较C/C基因型患者FINS、HOMA-IR水平升高, 但差异均无统计学意义。提示HL-514C/T多态性与2型糖尿病患者胰岛素抵抗无关。究竟这一多态性是否与胰岛素抵抗相关需扩大样本量，严格控制试验条件，进一步深入研究。

综上所述， HL-514C/T基因多态性可能与2型DM的发生无相关性，与2型糖尿病患者胰岛素抵抗亦无关。HL-514T等位基因可能是2型DM患者发生高TG血症的危险因素。但是单一基因的单个位点变化不足以观察整个HL 基因对糖尿病的影响，HL-514C/T 多态性可能不是影响HL活性的惟一因素，将来可对HL 基因启动子、外显子多个位点进一步研究以更好地揭示其与糖尿病的内在联系。

1 Atheroselerosis TG.Diabetes and lipoproteins[J]. Expert Rev Cardiovase Ther, 2010, 8(2): 1015-1029.

2 李萌．肝脂酶基因多态性与血脂和冠心病的关系[J]．内科，2009，4(2)：253-255．

3 Gündogdu F,Gurlertop Y,Pirim I,et al.Association between -514C->T polymorphism of the hepatic lipase gene and coronary artery disease in a Turkish population[J]. Acta Cardiol, 2008, 63(2): 197-202.

4 李宏义，鄢盛恺，严晓伟．汉族人肝脂酶基因启动子-514C/T多态性与2型糖尿病合并冠心病的关系[J]．中华检验医学杂志，2005，28(4)：373-377．

5 Ghatreh-Samani K, Noori M, Nobar MR,et al.The -514C/T polymorphism of hepatic lipase gene among iranian patients with coronary heart disease[J]. Iran J Public Health, 2012, 41(1): 59-65.

6 Soyal S M, Sandhofer A, Hahne P, et al. Cholesteryl ester transfer protein and hepatic lipase gene polymorphisms: effects on hepatic mRNA levels, plasma lipids and carotid atherosclerosis[J]. Atherosclerosis, 2011, 216(2): 374-380.

7 李晓莉，张鹏，高峰，等．肝脂酶启动-514C/T多态性与冠心病的关系[J]．心血管康复医学杂志，2013，22(4)：330-334．

8 杨伟，李耘，冯明.老年2型糖尿病伴原发性非酒精性脂肪肝患者胰岛素抵抗与血清抵抗素关系[J].疑难病杂志，2013，12(4)：308.

9 许冰.细胞因子与2型糖尿病胰岛素抵抗的相关性研究[J].中国医药，2009，4(11):879.

10 谭子新,吴楠.格列吡嗪缓释片联合二甲双胍对新诊断2型糖尿病患者胰岛素抵抗的影响[J].河北医药，2011,33(17)：2642.

11 潘佳秋，姜飞飞，刘静.新诊断2型糖尿病患者血清脂肪甘油三酯脂酶及抵抗素与胰岛素抵抗的关系研究[J].中国全科医学，2012，15(6)：2017.

12 崔洁，杨文东.妊娠期高血压疾病患者血清脂联素及内脂素水平与胰岛素抵抗的相关性研究[J].实用心脑肺血管病杂志，2013，21(5):38.

13 Yasuyoshi Y,Noma K, Nakatani K, et al. C-514T polymorphism in hepatic lipase gene promoter is associated with elevated triglyceride levels and decreasing insulin sensitivity in nondiabetic Japanese subjects[J]. Int J Mol Med, 2005, 16(3): 421-425.

Associationofhepaticlipasegenepromoterregion514C/Tpolymorphismwithlipidmetabolismandinsulinresistanceintype2diabetesmellitus

SHIRou*,LEIYouming,LIHuifang,SONGDianping.

*DepartmentofEndocrine,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China

SONGDianping，E-mail:drsongdp@126.com

ObjectiveTo investigate the correlation among the hepatic lipase (HL) gene promoter 514C/T polymorphism, type 2 diabetes (DM) lipid metabolism and insulin resistance (IR).MethodsApplication the restriction fragment length polymorphism analysis of polymerase chain reaction (PCR-RFLP) combined with DNA sequencing technology, 284 cases of type 2 DM patients (DM group) and normal glucose tolerance in 197 healthy subjects (group NC) were enrolled and underwent for HL-514C/T polymorphism detection, and to observe the correlation between the gene polymorphism, serum lipid metabolism and IR.Results(1) The patients in the DM group with C/C and C/T+T/T genotypes frequencies were 39.2% and 60.8%, C and T allele frequencies were 64.5% and 35.5%, NC group were 32.7%, 67.3% and 63.2%, 36.8%, 2 groups had no significant difference (P>0.05). (2) The patients with C/T+T/T genotype three triglyceride level of DM group was (2.93±1.37) mmol/L, C/C genotype were (2.07±1.82) mmol/L, there was significant difference between the 2 groups (P<0.05), the difference of rest indices were not statistically significant(P>0.05).(3)The differences of rele-vant indices of C/T+T/T genotype and C/C genotype patients' IR were not significantly (P>0.05). (4) Logistic regression analysis showed that, DM group's HL-514C/T gene polymorphisms, BMI were positively correlated with TG anomalies (OR=3.042, 95%CI 1.265-7.317；OR=2.600, 95%CI 1.520-4.447,P<0.05).ConclusionThe HL-514C/T gene polymorphism may had negative correlation with type 2 DM, as well with IR in type 2 DM, while the HL-514T allele may be a risk factor for patients with type 2 DM had high levels of TG.

Hepatic lipase gene; Diabetes; Lipid metabolism; Insulin resistance;Molecular genetics

650032 昆明医科大学第一附属医院内分泌二科(石柔、宋滇平、李会芳)，干疗科(雷又鸣)

宋滇平，E-mail:drsongdp@126.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.07.013

2014-02-19)