余柯达， 路 梅， 叶美娟， 凌丹燕

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

胶孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz)是引起植物炭疽病的病原真菌，可侵染花、果实、叶片和枝梢等植物各个器官，常引起落花、落叶、落果、枝梢枯死、树皮爆裂、贮藏期果实腐烂等症状，造成树势衰弱及减产减收[1-2]．目前，对植物炭疽病的防治主要以化学防治为主，但是由于连续多年单一性杀菌剂的大量使用，导致该病菌在不少地区出现了较强的抗药性，致使农药的效果大幅下降[3]．已有研究表明，芒果和油茶的炭疽病病原真菌已对苯并咪唑类杀菌剂多菌灵等产生了抗性[4-5]．对芳香樟炭疽病的防治研究也发现，多年使用的保护性杀菌剂波尔多液对病害的防治效果已经很低[6]．杀菌剂主要分为3类：一类是具有高效内吸作用的内吸型杀菌剂，如苯并咪唑类杀菌剂多菌灵；另一类是具有保护治疗作用的保护型杀菌剂，如二甲酰亚胺类杀菌剂异菌脲；第3类是具有复合防治作用的杀菌剂，如低毒的三唑类新一代强力杀菌剂苯甲丙环唑．有效中浓度或半数有效浓度(median effect concentration，EC50)是衡量杀菌剂毒力的重要指标，其值大小的改变程度是产生抗药性的标志[7]．

浙江省金华市是国内茶花和佛手的主要产区之一，炭疽病发生普遍，严重影响了植物的观赏和经济价值．迄今为止，对于佛手和四季茶花炭疽病防治中病原菌对杀菌剂敏感性的研究尚未见报道．本研究采用菌丝生长速率法测定了3种类型6种杀菌剂对四季茶花和佛手炭疽病菌的室内毒力，明确了病原菌对杀菌剂的敏感性现状，为科学防治植物炭疽病害提供实验依据．

1 材料与方法

1.1 菌株

茶花和佛手胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)由本实验室分离纯化并保藏．

1.2 供试杀菌剂

1)保护型杀菌剂：2%波尔多液悬浮液SC(自配)；50%异菌脲悬浮剂FW(深圳诺普信农化股份有限公司)．

2)内吸型杀菌剂：50%多菌灵可湿性粉剂WP(上海泸联生物药业(夏邑)有限公司)；15%恶霉灵可湿性粉剂WP(陕西西大华特科技实业有限公司)．

3)复合型杀菌剂：80%多福锌可湿性粉剂WP(河北冠龙农化有限公司)；30%苯甲丙环唑乳油EC(青岛润生农化有限公司)．

1.3 供试杀菌剂对病原菌的毒力测定

根据使用说明，将适量的杀菌剂溶入6 mL无菌水中，再加入到含54 mL马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的锥形瓶中(培养基温度为60 ℃左右)，混合均匀后倒平板，以无菌水作空白对照．将保藏的炭疽病病原菌活化培养，25 ℃黑暗条件下培养7 d，再在其菌落边缘用灭菌的打孔器移取7 mm直径的菌丝块接种到带药平板培养基上，每处理设置3个重复，在25 ℃恒温培养箱中培养，待对照菌落直径长至培养皿直径的约2/3时，用十字交叉法测量菌落直径，计算菌落直径平均值和菌丝生长抑制率.菌丝生长抑制率计算公式为

将菌丝生长抑制率换算成概率值(y)、杀菌剂浓度(x)，应用Excel软件求出各杀菌剂的毒力，按浓度与概率值回归法求得线性回归方程y=a+bx，并以回归方程计算各供试杀菌剂对茶花和佛手炭疽病病原菌的抑制中浓度(EC50)[8]．

2 结果与分析

2.1 杀菌剂浓度设置

实验所用每种杀菌剂的浓度设置依据杀菌剂的使用说明进行系列室内毒力测定预试验结果确定．以保护型杀菌剂50%异菌脲悬浮剂FW为例，图1和图2显示了不同浓度的异菌脲对2株病原菌的抑制作用.由图1和图2可见，随着异菌脲浓度的减少，病原菌的菌落直径明显增加.结合50%异菌脲悬

图1 茶花炭疽病菌在不同浓度异菌脲作用下的生长状况图

杀菌剂有效成分的质量浓度/(mg5L-1)2%波尔多液悬浮液SC66.6750.0040.0028.5710.00/50%异菌脲悬浮剂FW255.00127.5085.0031.8812.755.1050%多菌灵可湿性粉剂WP1 000.00333.33100.0050.0025.0016.7715%恶霉灵可湿性粉剂WP1 500.001 000.00500.00100.0020.002.0080%多福锌可湿性粉剂WP16.001.600.600.060.006/30%苯甲丙环唑乳油EC20.002.000.200.02//

注：有效成分质量浓度的设置按照每种杀菌剂的使用说明和预试验结果确定．

浮剂防治炭疽菌等真菌病害的使用浓度(1 000～1 500倍液)，最终选择的异菌脲使用浓度为255.00，127.50，85.00，31.88，12.75，5.10 mg/L．其他杀菌剂的抑菌实验存在同样的趋势．通过预试验最终确定的6种杀菌剂有效成分的质量浓度见表1．

2.2 保护型杀菌剂对茶花和佛手炭疽病原菌的毒力测定

保护型杀菌剂对茶花和佛手炭疽病原菌的毒力测定结果见表2．由表2可见：2%波尔多液对茶花和佛手炭疽菌的EC50值差异较大，分别为105.848 2 mg/L和214.870 8 mg/L；50%异菌脲对2种病原菌的EC50则较为接近，分别为109.081 0 mg/L和105.525 7 mg/L．但是，2种杀菌剂对供试菌株的EC50均大于100 mg/L，说明2种来源炭疽菌对2%波尔多液和50%异菌脲的敏感性较低，已经产生了一定的抗药性．

表2 保护型杀菌剂对茶花和佛手炭疽病菌室内毒力测定结果

2.3 内吸型杀菌剂对茶花和佛手炭疽病原菌的毒力测定

内吸型杀菌剂对茶花和佛手炭疽病原菌的毒力测定结果由表3可见：2种杀菌剂对供试菌株的EC50值为2 163.898 1～4 260.781 5 mg/L，均大于1 000 mg/L．表示2种来源的供试菌株对内吸型杀菌剂50%多菌灵和15%恶霉灵的敏感性非常低，已经产生很强的抗药性．

表3 内吸型杀菌剂对茶花和佛手炭疽病菌室内毒力测定结果

2.4 复合型杀菌剂对茶花和佛手炭疽病原菌的毒力测定

复合型杀菌剂对茶花和佛手炭疽病原菌的毒力测定结果见表4．表4中，30%苯甲丙环唑和80%多福锌对2株供试菌株的EC50值为2.287 8～10.408 0 mg/L，远远低于保护型杀菌剂和内吸型杀菌剂．实验数据说明茶花和佛手炭疽病原菌对2种杀菌剂的敏感性很高，进而表明复合型杀菌剂适用于植物炭疽病的防治．

表4 复合型杀菌剂对茶花和佛手炭疽病菌室内毒力测定结果

3 结论与讨论

杀菌剂室内毒力测定中EC50越小、斜率越大,说明病原菌对杀菌剂的反应灵敏度越高，即随着杀菌剂浓度的增加，抑制率明显增大[9]．对实验结果进行相关回归分析得出每种杀菌剂的毒力回归方程和斜率，回归方程的斜率与病原菌对杀菌剂的敏感性成正比．供试6种杀菌剂对茶花和佛手炭疽病菌毒力回归方程的斜率分别为：2%波尔多液0.545 6和0.229 8；50%异菌脲0.119 7和0.118 9；50%多菌灵0.021 6和0.013 1；15%恶霉灵0.013 4和0.011 9；30%苯甲丙环唑16.697和13.068；80%多福锌5.465 8和4.426 6．综合EC50和毒力回归方程的斜率，可以得出以下结论：首先，2种来源的供试菌株对6种杀菌剂的敏感性大小顺序依次为：30%苯甲丙环唑>80%多福锌>2%波尔多液>50%异菌脲>50%多菌灵>15%恶霉灵；其次，2种来源的供试菌株对不同类型杀菌剂的敏感性差异较大，内吸型杀菌剂的EC50值近乎是保护型杀菌剂的百倍、复合型杀菌剂的千倍．

多菌灵和甲基硫菌灵同属于苯并咪唑类杀菌剂．国内已有研究证明胶孢炭疽菌对苯并咪唑类杀菌剂的敏感性低．例如，陈聃等[10]采用区分剂量法对浙江省葡萄炭疽病的抗药性进行了研究，结果发现，供试菌株群体对甲基硫菌灵的抗药性频率为37.04%，且均为高水平抗药性菌株(Ben HR)，即能在含杀菌剂 100 mg/L平板上生长的菌株．本研究结果也证明，胶孢炭疽菌已经对多菌灵等咪唑类内吸型杀菌剂产生抗性；而且多菌灵对茶花和佛手的胶孢炭疽菌的EC50竟分别高达2 163.898 1和3 595.633 6 mg/L，说明供试菌株的抗药性远远高于陈聃等的实验结果．

胶孢炭疽菌具有潜伏侵染特性[11]，其分生孢子侵染和再侵染是病害发生和传播的主要途径．因此，杀菌剂对分生孢子萌发抑制率的高低是病害控制的关键之一．2013年刘霞等[12]对核桃炭疽病原菌胶孢炭疽菌的室内毒力研究发现，异菌脲等杀菌剂对分生孢子萌发有很强的抑制作用．本研究采用的菌丝生长速率法测定了不同杀菌剂对菌株的抑菌作用，关于所用杀菌剂对孢子萌发率的影响研究正在进行当中．

综上所述，建议：停用多菌灵等病原菌已经产生抗性的内吸型杀菌剂；生产实际中可用30%苯甲丙环唑和80%多福锌这2种复合型杀菌剂进行炭疽病害的防治，少用或轮换使用保护型杀菌剂．由于田间自然环境中病原物、寄主和环境之间存在着复杂的关系，本研究所用杀菌剂在田间的抑菌效果尚需进一步的实验验证．

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