刘建中， 张双双， 许 为

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

植物应对干旱等环境胁迫是通过基因表达的调控实现的[1-3].脱落酸(abscisic acid,ABA)在植物的生长发育中起着许多作用，其中最主要的功能是调控植物体内的水分平衡和耐逆性，这一点在多种ABA缺失突变体中被充分证明[4-5].在干旱胁迫时，植物体内会积累大量的ABA.ABA主要通过调控保卫细胞来维持水分平衡[1,4-5].干旱胁迫时，ABA积累主要是通过激活ABA合成和抑制ABA降解实现的.几种ABA合成的基因已经被克隆[6-8].ABA受体也已被克隆[9].ABA与受体结合，可解除蛋白磷酸酶2C(PP2C)对蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族2(SnRK2)的抑制，从而使SnRK2磷酸化ABF2.ABF2的磷酸化可增强其结合ABA顺式应答元件(ABA responsive element,ABRE)，启动抗逆相关基因的表达[1-3].ABA途径的启动伴随产生肌醇三磷酸(IP3)和环腺苷酸二磷酸核糖(cADPR)，激活胞内钙库中Ca2+的释放.同时，胞外Ca2+也可经过质膜上的Ca2+通道内流，使胞内Ca2+浓度升高.另外,ABA还可诱导胞质碱化.胞内Ca2+和pH升高可激活胞内蛋白激酶/蛋白磷酸酶的活性，从而调节质膜上相关的离子通道，如激活质膜上相关的阴离子通道和K+外流通道，钝化K+内流通道，从而诱导气孔关闭或抑制气孔开放[2-3,10].

NO(nitric oxide)是一种极其简单的气态小分子物质，容易透过细胞膜扩散进入细胞后发挥重要的功能[11].NO是哺乳动物中发现最早和研究最广泛的信号分子之一[12].NO在植物中的作用直到20世纪90年代才引起植物学家们的关注，现已成为植物生物学领域的一个研究热点[11-12].在植物中受NO调控的生物学过程包括种子萌发、叶片衰老、开花生理、气孔关闭、细胞死亡及对病原菌的免疫反应[11-12].哺乳动物中NO的合成是通过NO合成酶(NOS)将精氨酸转化为NO的[12].相比之下，植物中NO的生物合成则比较复杂[12].2003年，美国Crowford实验室发现了一个可能的拟南芥NOS基因AtNOS1，atnos1突变体中NO的水平较野生型显著降低[13].后来的研究发现AtNOS1并非一氧化氮合成酶，但其确实与NO在植物体内的积累相关，故其命名为一氧化氮相关蛋白1(NO-associated protein 1,AtNOA1)[14].AtNOA1属于环状鸟苷酸三磷酸酶(cGTPases)家族，定位于质体或线粒体上，在叶绿体的核糖体组装和后续的mRNA翻译成蛋白质过程中起重要作用[15].但AtNOA1与合成NO之间的关系还需进一步研究确定.在拟南芥突变体noa1中，NO的合成、植株生长发育和ABA诱导的气孔关闭均受损[13].

NO在植物抗病、抗逆及生长发育等方面均起着重要的作用,但NO在植物抗旱或耐旱中的作用还不明确.已知干旱胁迫下ABA诱导的气孔关闭在植物抗旱或耐旱中起着关键性作用[1-2].文献[13]发现拟南芥nos1/noa1突变体叶片中ABA诱导的气孔关闭的调节受损.据此推理，nos1/noa1在干旱条件下保持水分的能力降低，抗旱或耐旱性降低.然而，新近的报道表明拟南芥noa1-2及nia1nia2noa1-2突变体(NIA1及NIA2是通过硝酸盐途径合成NO的关键酶)的抗旱能力明显高于野生型，而其抗旱能力的增强与ABA诱导气孔的有效关闭及诱导抗旱相关基因的表达呈正相关[16].鉴于上述情况，有必要对NO在抗旱中的作用进行进一步的研究.

NO与半胱氨酸直接结合生成的亚硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione,GSNO)是细胞内主要的NO供体.GSNO作为NO在细胞内的临时储蓄库，可以将NO反式转移到蛋白质半胱氨酸的巯基(—SH)上，即发生亚硝基化的反式转移(trans-S-nitrosylation)[17].亚硝基谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathione reductase 1,GSNOR1)[18]和硫氧还原蛋白(thioredoxin,TRX)[19]是去亚硝基化的2个关键酶.gsnor1-3是一个GSNOR1功能缺失突变体，拟南芥GSNOR1参与调控植物生长发育和病原菌防御[20].但GSNOR1在抗旱中的作用还不清楚.

由于目前对NO信号分子在植物抗旱相关基因表达中的作用了解甚少，笔者系统地对8种不同类型共12个抗旱相关基因在干旱处理不同时间的拟南芥野生型和noa1及亚硝基谷胱甘肽还原酶功能缺失突变体gsnor1-3间的表达情况进行了分析.与已报道的结果不一致，本文的反转录PCR(RT-PCR)结果表明，抗旱相关基因的表达在不同基因型间无显著差异，noa1的耐旱性与抗旱相关基因的表达无显著的相关性.

1 材料与方法

1.1 材料

野生型拟南芥Col-0(Columbia-0)生态型.NO相关突变体gsnor1-3由英国爱丁堡大学的Gary Loake教授[20]提供.noa1由美国加州大学圣地亚哥分校的Nigel Crowford教授[13]提供.

1.2 拟南芥培养

在无菌1.5 mL离心管中置入适量的种子，加入800 μL 100 g/L NaClO+1 g/L Tritron溶液，置于水平摇床上，轻轻摇动12 min左右，然后离心，去除上清;用800 μL重蒸馏水清洗种子5～8次，放置于4 ℃冰箱中3 d，破除种子休眠.将破除休眠的种子用移液器点在1/2MS培养基(pH 5.7)上，置于拟南芥生长室或光照培养箱(16 h光照,8 h黑暗;光照下22 ℃，黑暗下20 ℃；湿度80%)中.萌发5～6 d后将幼苗移入土中.

1.3 干旱处理与反转录PCR分析

长日照条件下生长3周的不同基因型拟南芥(Col-0，gsnor1-3,noa1)一次性浇足量的水，然后开始干旱处理.分别在干旱处理0，5，10和15 d时取莲座叶用Trizol法提取总RNA，然后取等量总RNA用TOYOBO公司的反转录试剂盒进行反转录,在得到cDNA后进行PCR扩增.PCR所用的引物信息见表1.

表1 RT-PCR引物信息

2 结果与讨论

长日照条件(光照,22 ℃，16 h；黑暗,20 ℃，8 h；湿度80%)下生长3周的拟南芥(Col-0，gsnor1-3,noa1)，每种材料均一次性浇足量的水，然后开始干旱处理.分别在断水0，5，10和15 d时取莲座叶提取总RNA,然后进行反转录得到cDNA，对已知的不同抗旱相关基因进行RT-PCR扩增，实验结果如图1所示.从RT-PCR结果可以看出，在断水5 d时所有基因均无明显的诱导表达，到10 d时大多数基因有较强的诱导表达.原因是在断水5 d时植物还未遭受干旱胁迫，在断水10 d时植物才经历干旱胁迫.到干旱处理15 d时，大多数基因的诱导表达较10 d时下降，但只有个别基因的诱导表达在15 d时高于在10 d时.

各基因的表达情况总结如下：

1)RD29A/RD29B

RD29是干旱响应基因，首先由Yamaguchi-Shinozaki等[21]于1993年克隆出来.这两个基因的转录受干旱和ABA高度诱导[21-24].RD29A启动子中同时含有ABA顺式应答元件(ABA responsive element,ABRE)和干旱应答元件(Dehydration responsive element,DRE)，而RD29B启动子只有ABA顺式应答元件(ABRE)[22-23].细胞缺水时，植物可以启动RD29A的表达[21-24].将RD29启动子和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)或luciferase等报告基因融合在一起导入拟南芥和烟草中,创制出的转基因株系是研究干旱、ABA、冷害和高盐等胁迫的良好指示性材料[25-26].

RD29A的表达量在各基因型中均较RD29B高.在干旱处理10 d时，在所有基因型中RD29A均有较强的诱导表达；但在gsnor1-3中的表达量在不同处理时间段均较Col-0和noa1低.RD29B仅在干旱处理10 d时的所有基因型中有较强的诱导表达,但表达量在基因型间无差异.

1为Col-0;2为gsnor1-3;3为noa1图1 不同干旱处理时间抗旱相关基因在拟南芥不同基因型中的表达

2)DREB/CBF家族

DREB(dehydration responsive element binding protein)或C-重复结合因子(C-repeat binding factor，CBF)是与RD29A核心区域内的顺式作用元件DRE相结合的转录因子，可以调控植物对干旱、低温、高盐等逆境应答相关基因的表达[1-3].DREB2蛋白翻译后需受干旱等逆境胁迫激活才起作用[27].研究表明，DREB2A的中心存在一个负调控区域，删除该负调控域后就可得到组成型的DREB2A(无需干旱等诱导激活)，可以调控许多脱水胁迫诱导基因的表达，并能显著提高转基因拟南芥在水分胁迫时的耐受性[28].

DREB1A/CBF3：在所有基因型中和不同干旱时间均有诱导表达，但在干旱处理15 d时表达量最高，且不同基因型间无显著差异.

DREB1C/CBF2：在干旱处理前，在所有基因型中均有较低水平的表达；在断水5 d时表达量下降至不可检测水平；但干旱处理10 d时，诱导表达量较高；干旱处理15 d时表达量又下降.除了干旱处理15 d时在gsnor1-3中表达量较高外，其他时间段的表达量在各基因型间无差异.

DREB1D/CBF4：所有基因型中仅干旱处理15 d时有诱导表达.无论是在干旱处理前还是处理后，在gsnor1-3中的表达量均最低.

DREB2：仅Col-0在断水5 d时有显著的诱导表达.

3)NCED3

9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoiddioxygenase,NCED) 是高等植物中ABA生物合成途径中的一个关键酶[7-8].NECD催化的反应是ABA生物合成中的限速步骤，在拟南芥中过表达NCED3基因可以大大提高植株的耐旱性[8].NCED3在干旱处理10 d时有诱导表达，但其在所有基因型中的诱导表达均无显著差异.

4)P5CS

1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)兼具γ-谷氨酰基激酶及半-γ-谷氨酸脱氢酶(glutamic-gamma-semialdehyde dehydrogenase)的活性，催化与抗旱密切相关的脯氨酸生物合成的前两步[29].在拟南芥所有基因型中，只在干旱处理10 d时有诱导表达，但在noa1中的表达量低于在Col-0和gsnor1-3中的表达量.

5)HK1

拟南芥组氨酸蛋白激酶1(histidine protein kinase,AHK1或HK1)是干旱、盐及ABA信号途径的正调控因子，其作用于DREB2A等蛋白的上游，分别通过依赖于和不依赖于ABA 的信号途径调控胁迫反应[3,30].在干旱处理5和15 d时，其在noa1和gsnor1-3中的表达高于在Col-0中的表达.

6)LWT1

其功能是通过抑制脯氨酸脱氢酶(PDH)介导的脯氨酸降解实现在低温和干旱胁迫下脯氨酸积累的增加，达到适应干旱胁迫.在干旱处理0及5 d时，LWT1在所有基因型中均无表达；在干旱处理10 d时，在所有基因型中均有高诱导表达，但在gsnor1-3中表达量最高；在干旱处理15 d时，在所有基因型中的表达量较干旱处理10 d时均有所下降，在Col-0中下降到几乎不可检测水平.

7)CKX1

降低细胞分裂素(cytokinin,CK)的水平可造成植物根系增大从而增强植物的抗旱性.细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(cytokinin oxidase/dehydrogenase,CKX)是降解细胞分裂素的主要酶,过表达CKX可增强植物的抗旱和抗盐性[31].在干旱处理前，在Col-0中有较强的表达，在noa1和gsnor1-3中的表达量较低；在干旱处理5 d时，在所有基因型中的表达量均下降；在干旱处理10 d时，在所有基因型中均有较强的诱导表达，但其表达量在不同基因型间无显著差异；干旱处理15 d时，表达量下降到干旱处理5 d时的水平.

8)MMS21

拟南芥MMS21是一个SUMO E3连接酶，对拟南芥抗旱性起负调控作用.mms21突变体抗旱性增强，而过表达MMS21则降低拟南芥的抗旱性[32].无论是在干旱处理前还是处理后，其表达量在gsnor-3中均高于在Col-0和noa1中；而其表达在Col-0和noa1间无显著差异.

从以上基因的表达情况来看，noa1的耐旱性并不与这些抗旱相关基因的表达显著相关.仅HK1在干旱处理5和15 d时，在noa1中的表达量高于在Col-0中的表达量.而gsnor1-3对干旱的敏感性则与RD29A和CBF4/DREB1D的诱导表达降低相关.但CBF2/DREB1C，LWT1，MMS21在gsnor1-3中的表达量高于在Col-0 和noa1中的.文献[16]报道RD29B基因在有或无ABA处理的情况下在noa1-2突变体中的表达均高于在野生型中的表达.而本文的结果表明RD29B基因的表达在干旱处理前后在noa1突变体与野生型间无显著差异(见图1).造成与文献[16]报道结果不一致的原因，可能与本实验和文献[16]所用材料的生长发育时期、生长条件、诱导基因表达方法的不同有关.另，笔者研究的同盆及异盆抗旱实验结果表明，所用基因型植株大小对抗旱鉴定的结果至关重要(待发表).noa1植株及叶片较小，在干旱条件下通过蒸腾作用失水较少，可能是其在异盆实验中较野生型耐旱的主要原因.

参考文献：

[1]Zhu Jiankang.Salt and drought stress signal transduction in plants[J].Annu Rev Plant Biol,2002,53:247-273.

[2]Bartels D,Sunkar R.Drought and salt tolerance in plants[J].Crit Rev Plant Sci,2005,24(1):23-58.

[3]Shinozaki K,Yamaguchi-Shinozaki K.Gene networks involved in drought stress response and tolerance[J].J Exp Bot,2007,58(2):221-227.

[4]Koornneef M,Léon-Kloosterziel K M,Schwartz S H,et al.The genetic and molecular dissection of abscisic acid biosynthesis and signal transduction inArabidopsis[J].Plant Physiol Biochem,1998,36(1/2):83-89.

[5]Liotenberg S,North H,Marion-Poll A.Molecular biology and regulation of abscisic acid biosynthesis in plants[J].Plant Physiol Biochem,1999,37(5):341-350.

[6]Marin E,Nussaume L,Quesada A,et al.Molecular identification of zeaxanthin epoxidase ofNicotianaplumbaginifolia,a gene involved in abscisic acid biosynthesis and corresponding to the ABA locus ofArabidopsisthaliana[J].EMBO J,1996,15(10):2331-2342.

[7]Taylor I B,Burbidge A,Thompson A J.Control of abscisic acid synthesis[J].J Exp Bot,2000,51(350):1563-1574.

[8]Iuchi S,Kobayashi M,Taji T,et al.Regulation of drought tolerance by gene manipulation of 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,a key enzyme in abscisic acid biosynthesis inArabidopsis[J].Plant J,2001,27(4):325-333.

[9]Klingler J P,Batelli G,Zhu J K.ABA receptors:the START of a new paradigm in phytohormone signalling[J].J Exp Bot,2010,61(12):3199-3210.

[10]Xu Sha,Zhou Jingwen,Liu Liming,et al.Arginine:a novel compatible solute to protectCandidaglabrataagainst hyperosmotic stress[J].Process Biochem,2011,46(6):1230-1235.

[11]Zhou Kun,Zhang Jinjin.Nitric oxide in plants and its role in regulating flower development[J].Yi Chuan,2014,36(7):661-668.

[12]Guo Fangqing,Crawford N M.Arabidopsisnitric oxide synthase1 is targeted to mitochondria and protects against oxidative damage and dark-induced senescence[J].Plant Cell,2005,17(12):3436-3450.

[13]Guo Fangqing,Okamoto M,Crawford N M,et al.Identification of a plant nitric oxide synthase gene involved in hormonal signaling[J].Science,2003,302(5642):100-103.

[14]Crawford N M,Galli M,Tischner R,et al.Response to Zemojtel et al:Plant nitric oxide synthase:back to square one[J].Trends Plant Sci,2006,11(11):526-527.

[15]Moreau M,Gyu In Lee,Wang Yongzeng,et al.AtNOS/AtNOA1 is a functionalArabidopsisthalianacGTPase and not a nitric-oxide synthase[J].The Journal of Biological Chemistry,2008,283(47):32957-32967.

[16]Lozano-Juste J,Leo′n J.Enhanced abscisic acid-mediated responses innia1nia2noa1-2 triple mutant impaired in NIA/NR- and AtNOA1- dependent nitric oxide biosynthesis inArabidopsis[J].Plant Physiology,2010,152(2):891-903.

[17]Hess D T,Stamler J S.Regulation byS-nitrosylation of protein post-translational modification[J].J Biol Chem,2012,287(7):4411-4418.

[18]Liu Liming,Hausladen A,Zeng Ming,et al.A metabolic enzyme forS-nitrosothiol conserved from bacteria to humans[J].Nature,2001,410(6827):490-494.

[19]Benhar M,Forrester M T,Hess D T,et al.Regulated protein denitrosylation by cytosolic and mitochondrial thioredoxins[J].Science,2008,320(5879):1050-1054.

[20]Feechan A,Kwon E,Yun B W,et al.A central role forS-nitrosothiols in plant disease resistance[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(22):8054-8059.

[21]Yamaguchi-Shinozaki K,Shinozaki K.ArabidopsisDNA encoding two desiccation-responsive rd29 genes[J].Plant Physiol,1993,101(3):1119-1120.

[22]Yamaguchi-Shinozaki K,Shinozaki K.Characterization of the expression of a desiccation-responsive rd29 gene ofArabidopsisthalianaand analysis of its promoter in transgenic plants[J].Mol Gen Genet,1993,236(2/3):331-340.

[23]Yamaguchi-Shinozaki K,Shinozaki K.A novelcis-acting element in anArabidopsisgene is involved in responsiveness to drought,low-temperature,or high-salt stress[J].Plant Cell,1994,6(2):251-264.

[24]Msanne J,Lin Jiusheng,Stone J M,et al.Characterization of abiotic stress-responsiveArabidopsisthalianaRD29A and RD29B genes and evaluation of transgenes[J].Planta,2011,234(1):97-107.

[25]Xiong Liming,Karen S S,Zhu Jiankang.Cell signaling during cold,drought and salt stress[ J].The Plant Cell,2002(3):S165-S183.

[26]Kasuga M,Liu Qiang,Miura S,et al.Improving plant drought,salt,and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor[J].Nature Biotechnology,1999,17(3):287-291.

[27]Sakuma Y,Maruyama K,Osakabe Y,et al.Functional analysis of anArabidopsistranscription factor,DREB2A,involved in drought-responsive gene expression[J].Plant Cell,2006,18(5):1292-1309.

[28]Liu Qingyan,Sakuma Y,Abe H.Two transcription factors,DREB1 and DREB2,with an EREBP/AP2 DNA binding domain,separate two cellular signal transduction pathways in drought and low temperature-responsive gene expression,respectively,inArabidopsis[J].Plant Cell,1998,10(8):1391-1406.

[29]Hu C A,Delauney A J,Verma D P.A bifunctional enzyme (delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase) catalyzes the first two steps in proline biosynthesis in plants[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(19):9354-9358.

[30]Tran L S,Urao T,Qin Feng,et al.Functional analysis of AHK1/ATHK1 and cytokinin receptor histidine kinases in response to abscisic acid,drought,and salt stress inArabidopsis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(51):20623-20628.

[31]Werner T,Nehnevajova E，Kollmer I,et al.Root-specific reduction of cytokinin causes enhanced root growth,drought tolerance,and leaf mineral enrichment inArabidopsisand tobacco[J].The Plant Cell,2010,22(12):3905-3920.

[32]Zhang Shengchun,Qi Yanli,Liu Ming,et al.SUMO E3 ligase AtMMS21 regulates drought tolerance inArabidopsisthaliana[J].J Integr Plant Biol,2013,55(1):83-95.