杨学艺，卢小东，邵启祥，刘家秀，刘娟

（1.江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏镇江212013；2.淮阴卫生高等职业技术学校检验药学系，江苏淮安223300；3.淮安市第四人民医院检验科，江苏淮安223001）

靶向miR-126慢病毒表达载体的构建及意义

杨学艺1，2，卢小东1，邵启祥1，刘家秀2，刘娟3

（1.江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏镇江212013；2.淮阴卫生高等职业技术学校检验药学系，江苏淮安223300；3.淮安市第四人民医院检验科，江苏淮安223001）

目的：检测微小RNA-126（microRNA-126，miR-126）在CD4＋CD25＋调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）中的表达水平，同时构建基于慢病毒的miR-126反义寡核苷酸序列（antisense oligonucleotides，ASOs）表达载体。方法：实时定量PCR特异性探针法检测miR-126在Tregs中的表达水平；针对miR-126序列，设计合成其ASOs序列，退火后连接至经AgeⅠ酶和Eco RⅠ酶双酶切的pGCsil-LV-GFP载体上，连接产物转化DH5α感受态细胞，对经PCR鉴定为阳性的载体（命名为pGCsil-miR-126-ASOs）进行测序分析；将构建成功的pGCsil-miR-126-ASOs表达质粒和pHelper 1.0、pHelper 2.0质粒共转染293T细胞，浓缩病毒颗粒并测定所获病毒滴度；将制备好的病毒颗粒感染经TGF-β体外诱导培养的小鼠CD4＋CD62L＋初始T细胞，72 h后用流式细胞仪检测其Foxp3的表达变化。结果：实时定量PCR结果显示miR-126在CD4＋CD25＋Tregs中的表达明显高于CD4＋CD25－T细胞（P＜0.01）；测序结果证明成功构建pGCsil-miR-126-ASOs重组质粒载体，包装并获得高浓度的慢病毒颗粒，病毒滴度为9×108TU／m L；重组的病毒能明显抑制Tregs的外周诱导（P＜0.05）。结论：成功构建miR-126 ASOs的慢病毒表达载体，并获得高浓度的病毒颗粒。

微小RNA-126；CD4＋CD25＋调节性T细胞；反义寡核苷酸；慢病毒

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一组内源性、长度在22～24 nt的非编码单链小RNA分子，能在转录后水平通过促进靶mRNA的降解或抑制蛋白质翻译来负调控靶基因的表达，从而参与调控细胞的发育、分化和功能［1－2］。……