刘 璐，闫 浩，李 诚，李 源，周 杨，张庭廷

(安徽师范大学生命科学学院;生物环境与生态安全安徽省高校重点实验室，芜湖241000)

近年来，我国重特大重金属污染事件时有发生，其中，以铅污染尤为突出。由于进入水体中的重金属会随着食物链传递而在生物体内积累，破坏生物的正常代谢与功能，最终对水生态系统以及人类健康造成危害［1-2］。在水体重金属污染的防控研究中，浮游藻类因其某些独特的优势而备受关注。一方面藻类是水生生态系统的初级生产者，外来重金属的侵入必然会使生长在水体中的各种藻类首先受到不同程度的毒害，在对高等水生植物无可见伤害的低剂量污染情况下，藻类就可能出现形态和生理指标的变化［3］。因此，利用一些对重金属敏感的藻类作为指示生物，可以监测水体重金属污染的程度［4-9］。另一方面，浮游藻类生长速度快，不少藻类对重金属具有较强富集作用，因此浮游藻类被认为是一类处理水体中重金属污染的优良生物材料［10］，筛选适宜藻类去除水体中的重金属，被认为是一项高效、低耗、经济、环保、具有广阔应用前景的新型技术［11］。到目前为止，关于浮游藻类对重金属的吸附、吸收作用已有一些研究，但是重金属铅与水体最常见水华蓝藻铜绿微囊藻和常见绿藻斜生栅藻之间的相互作用却几乎未见报道。因此，本研究深入探讨了铅与铜绿微囊藻、斜生栅藻之间的相互作用，以便为铅污染的预警以及生物治理提供重要的理论与实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验藻种铜绿微囊藻(M.aeruginosa Kutz.)和斜生栅藻(S.obliquus(Turp.)Kutz.)均购自中科院武汉水生生物研究所，分别采用BG-11［12］和HB-4［13］培养基培养。

1.2 实验方法

1.2.1 藻的培养

实验前一周，两种藻分别用培养基进行扩大培养。无菌条件下，在已洗净灭菌的1000 mL三角锥形瓶中加入100 mL BG-11培养基，接入铜绿微囊藻藻种，摇匀，置光照培养箱中进行培养。培养条件:光照度4000 lx，光周期12L∶12D，温度(24±2)℃，pH值7.0。每天摇动锥形瓶4次，每24 h添加100 mL新鲜培养基，培养至藻细胞进入对数生长期。斜生栅藻的培养基用HB-4培养基，其他培养条件同铜绿微囊藻。

无菌条件下，取上述藻液分别加入到500 mL已灭菌三角烧瓶，加入新鲜无菌BG-11或HB-4培养基，然后加入Pb(NO3)2，铜绿微囊藻的起始密度为7.5×105个/mL，斜生栅藻的起始密度为3×105个/mL，Pb2+终浓度为3，6，9，12 mg/L，每组3个平行，对照组不加Pb(NO3)2，培养条件同藻种扩大培养。

1.2.2 相关试验指标的测定

主要测定的指标有:藻细胞的形态变化，藻细胞计数，测定反映膜通透性的电导率的变化，测定超氧化物阴离子自由基含量、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性以及藻细胞内Pb2+含量，除酶活力和Pb2+含量最后一天测定，其余各指标每隔24 h测定1次。

1.2.3 藻对铅的吸收处理方法

取藻液50 mL，用15 μg/mL的NaHCO3和蒸馏水各洗3次，然后烘干、称重及消化处理，用J-8000原子吸收分光光度计测定铅含量。

藻细胞形态的观察采用扫描电镜。取藻细胞，2500 rpm离心收获，采用无菌培养基洗2—3次，置于2.5%戊二醛中固定2 h，再用新鲜配制的0.1 mol/L PBS缓冲液冲洗3次，最后用系列乙醇(脱水剂的乙醇浓度依次为30%—50%—70%—80%—90%—100%乙醇(两次)脱水，醋酸异戊酯置换后，CO2临界点干燥，金属喷镀，扫描电镜观察。

1.3 数据处理

实验数据的处理采用SPSS13.0软件，图用Excel软件制作。对照组和处理组之间采用单因素方差分析，P＜0.05表示有显著性差异;P＜0.01表示有极显著性差异。

2 结果和分析

2.1 铅对两种藻生物量的影响

图1和图2是不同浓度Pb2+对两种藻生长动态的影响。图1显示，Pb2+对铜绿微囊藻的抑制强度与Pb2+浓度呈正相关。从第4天开始，浓度为3，6 mg/L处理组的藻细胞数均比同期对照组高;在第6天时，3 mg/L处理组与对照组差异达到极显著(P＜0.01)，说明低浓度(3 mg/L)Pb2+对铜绿微囊藻的生长有促进作用;然而9，12 mg./L处理组藻细胞数目始终低于同期对照组，在第6天时，两处理组与对照组相比差异极显著(P＜0.01)，说明高浓度(9，12 mg/L)Pb2+对铜绿微囊藻的生长有抑制作用。该结果表明在3—12 mg/L范围内，Pb2+对铜绿微囊藻的生长起着低促高抑的效果。

图2显示，不同浓度(3—12 mg/L)的Pb2+对斜生栅藻均有非常明显地抑制作用。从第1天开始，各处理组的藻细胞数目就明显低于同期对照组(P＜0.01)，说明Pb2+对斜生栅藻有较强的抑制作用。同时还表明，在Pb2+浓度为3—12 mg/L范围内，其对斜生栅藻的抑制作用要明显大于对铜绿微囊藻，说明了斜生栅藻对Pb2+的毒性敏感程度较铜绿微囊藻强烈。

图2 Pb2+对斜生栅藻生长的影响Fig.2 The effects of Pb2+on the growth of S.obliquus

2.2 铅对两种藻膜通透性的影响

如表1所示，随着Pb2+浓度的升高以及作用时间的延长，铜绿微囊藻藻液电导率的变化没有呈现出明显的变化规律，虽然在第2天，铜绿微囊藻3—9 mg/L处理组藻液电导率随Pb2+浓度的升高而逐渐上升，与同期对照组相比6，9 mg/L处理组差异显著(P＜0.05)，但在第6天，除最高浓度组(12 mg/L)与同期对照组相比差异显著(P＜0.05)外，其余各组却差异不显著。提示在Pb2+胁迫下，铜绿微囊藻细胞膜的通透性可有部分改变，但Pb2+对铜绿微囊藻的抑制作用可能还有更为复杂的作用机制。

表2显示，在第2、4天时，各处理组与同期对照组相比差异显著，均高于对照组，表明由于环境胁迫，斜生栅藻细胞膜首先受到影响，使一些小分子物质外渗，造成藻液电导率上升;但与Pb2+作用于铜绿微囊藻的结果相似，到第6天时，斜生栅藻各处理组电导率与同期对照组相比差异也无显著性，不能简单通过细胞膜通透性改变来解释Pb2+对此两种藻类的抑制作用机制。

表1 Pb2+对铜绿微囊藻藻液电导率的影响/×103Table1 Effect of Pb2+on conductivity of M.aeruginosa/×103

表2 Pb2+对斜生栅藻藻液电导率的影响/×103Table2 Effect of Pb2+on conductivity of S.obliquus/×103

表3 Pb2+对铜绿微囊藻含量的影响Table3 Effect of Pb2+oncontents of M.aeruginosa

表3 Pb2+对铜绿微囊藻含量的影响Table3 Effect of Pb2+oncontents of M.aeruginosa

表中数据为平均值±SE(n=3);*与同期对照组比较，P＜0.05;＊＊与同期对照组比较，P＜0.01

Pb2+浓度Pb2+contens/(mg/L)铜绿微囊藻O-·2含量O-·2contents of M.aeruginosa/(μmol/L)第0天第2天第4天第6天CK0.85±0.000.45±0.200.55±0.090.80±0.05 3 0.85±0.000.75±0.05＊＊0.65±0.20*0.90±0.05 6 0.85±0.000.80±0.00＊＊0.70±0.03*1.00±0.24*9 0.85±0.000.65±0.08＊＊0.75±0.09＊＊1.15±0.15＊＊120.85±0.000.70±0.14*0.80±0.50＊＊1.15±0.60＊＊

表4 Pb2+对斜生栅藻含量的影响Table4 Effect of Pb2+on contents of S.obliquus

表4 Pb2+对斜生栅藻含量的影响Table4 Effect of Pb2+on contents of S.obliquus

表中数据为平均值±SE(n=3);*与同期对照组比较，P＜0.05;＊＊与同期对照组比较，P＜0.01

Pb2+浓度Pb2+contens/(mg/L)斜生栅藻O-·2含量O-·2contents of S.obliquus/(μmol/L)第0天第2天第4天第6天CK0.20±0.000.20±0.220.20±0.060.25±0.10 3 0.20±0.000.30±0.03＊＊0.25±0.03*0.45±0.10＊＊6 0.20±0.000.30±0.35＊＊0.30±0.10＊＊0.45±0.17＊＊9 0.20±0.000.35±0.03＊＊0.45±0.26＊＊0.50±0.29＊＊120.20±0.000.55±0.08＊＊0.50±0.28＊＊0.55±0.29＊＊

2.4 铅对两种藻POD、CAT活性的影响

由图3可知，随着Pb2+浓度的增加，铜绿微囊藻和斜生栅藻藻细胞内的POD活性均呈先上升后下降的趋势，活性达到最大时，分别是对照组的166.16%(铜绿微囊藻实验组)和209.17%(斜生栅藻实验组)，之后逐渐降低，但即便是当POD的活性达到最低时，也分别是对照组的133.04%和124.40%。

由图3所示，铜绿微囊藻和斜生栅藻藻细胞内的CAT活性随Pb2+浓度的上升而增加，活性达到最大时，分别是对照组的255.40%和222.01%，与同期对照组相比差异极显著(P＜0.01)。

图3 不同浓度的Pb2+处理对铜绿微囊藻和斜生栅藻POD和CAT活性的影响Fig.3 Effects of different concentrations of Pb2+exposure on POD and CAT activities of M.aeruginosa and S.obliquus

2.5 两种藻对铅的吸收作用

如图4所示，随着藻液中Pb2+浓度的上升，铜绿微囊藻和斜生栅藻藻细胞中Pb2+含量均呈先上升后下降的趋势，在Pb2+浓度为9 mg/L时达最高，藻细胞内最高Pb2+含量分别为:22.73 mg/g、36.59 mg/g，表明在3—9 mg/L时，两种藻对Pb2+的吸收能力随Pb2+浓度的上升而增强，在9 mg/L以上浓度时两种藻吸收Pb2+的吸收能力开始下降，这可能由于高浓度时，Pb2+对两种藻的生长有较强抑制性，藻细胞功能受阻，以致对Pb2+的吸收能力开始下降。但单位量藻细胞内，斜生栅藻对Pb2+的吸收能力明显好于铜绿微囊藻

图4 不同Pb2+浓度下铜绿微囊藻和斜生栅藻细胞内Pb2+含量Fig.4 The intra-celluar Pb2+content of M.aeruginosa and S.obliquus under different concentrations of Pb2+treatment after 6 days

2.6 不同铅浓度下两种藻的表面结构

图5左侧图显示的是不同浓度下铜绿微囊藻藻细胞的表面结构，在不含Pb2+的条件下，藻细胞个体分明，细胞表面光滑;在低浓度(3—6 mg/L)时，藻细胞仍是个体分明，但细胞表面开始有絮状物，且絮状物随Pb2+浓度的上升而增加;在高浓度(9—12 mg/L)时，藻细胞表面和周围分布着大量的絮状物，细胞个体不分明，常见多个细胞及其细胞碎片粘合在一起。

图5右侧图显示的是不同浓度下斜生栅藻藻细胞的表面结构。同样，在不含Pb2+的条件下，藻细胞个体分明，细胞表面光滑;在浓度为3 mg/L的处理组中，藻细胞个体仍然分明，但细胞表面开始有絮状物;随着Pb2+浓度的上升，藻细胞表面和周围絮状物明显增多，细胞个体不分明，细胞形态改变，出现破裂现象，常见多个细胞及其细胞碎片粘合在一起。

由两组图比较可以看出，斜生栅藻对Pb2+较敏感，Pb2+对斜生栅藻的作用要强于对铜绿微囊藻，这与前面Pb2+对两组藻细胞生长趋势的影响一致。

3 结论与讨论

图5 不同Pb2+浓度下铜绿微囊藻和斜生栅藻细胞的表面结构Fig.5 Superficial structure of M.aeruginosa and S.obliquus under different concentrations Pb2+treatment after 6 days

3.1 Pb2+对斜生栅藻和铜绿微囊藻均具有明显的毒性作用，但对铜绿微囊藻的毒性要小于对斜生栅藻，且对铜绿微囊藻的生长具有双重影响，低浓度Pb2+能促进生长，这一结论与何学佳的研究结果一致［17］，而高浓度的Pb2+才抑制其生长，即低促高抑。这可能的原因较为复杂，一方面可能与该两藻细胞的表面结构不同有关;另外，是否铜绿微囊藻能通过释放微囊藻毒素对胞外的重金属离子进行络合，从而妨碍了重金属离子的跨膜转运，使铜绿微囊藻对重金属表现出一定的耐受性呢?有关藻毒素对重金属离子的生物有效性本课题组正在进行深入研究。从本研究Pb2+对两藻的毒性机制还可看出，高浓度的Pb2+不仅破坏了细胞膜的通透性，大量无机盐和有机物质外渗，而且通过两藻的细胞表面结构图可以看出两种藻细胞表面有大量絮状物，甚至出现粘连现象，这可能是由于细胞破裂后细胞碎片等与细胞粘结在一起所致。再者，Pb2+迫使细胞内含量增加，细胞膜脂质过氧化增强，当细胞内氧自由基浓度超过一定范围时，细胞内抗氧化酶系统不能将其及时清除，从而出现抗氧化酶活性开始升高以后降低的现象，抗氧化酶含量减少，又进一步加大了Pb2+对两种藻的毒害。

3.2 铜绿微囊藻和斜生栅藻对铅均有良好吸收作用。国内外大量研究都表明藻类对重金属具有较强的富集能力［18-21］。如孔石莼对Pb2+的单层饱和结合量为0.715 mg/g［20］，海带对Pb2+的吸附量为1.33 mmol/g［21］。然而像这些用海藻处理重金属的研究比较广泛，对于用淡水藻来处理重金属的研究却相对较少。本试验结果显示常见淡水藻铜绿微囊藻和斜生栅藻对Pb2+均有良好吸收作用。在一定范围(3—9 mg/L)内，两种藻对Pb2+的吸收能力随Pb2+浓度的上升而增强，在9 mg/L以上浓度时两种藻吸收Pb2+的吸收能力才开始下降;单位量藻细胞内，斜生栅藻对Pb2+的吸收能力要高于铜绿微囊藻。

综合以上结果，由于斜生栅藻对Pb2+更为敏感，因此，可以考虑如何能利用斜生栅藻来作为对重金属铅的敏感指示生物来监测水体Pb2+污染程度;同时，相比一些大型海藻如石莼，斜生栅藻对Pb2+具有较好的吸收作用，最高单位吸收量可达36.59 mg/g，而且斜生栅藻是不产生毒素的绿藻类，对环境污染较小，因此斜生栅藻具有开发成为处理水体铅污染良好生物材料的潜能。

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