白庆荣 谢昀烨 姜旭宇 孙慧颖 高 洁

(吉林农业大学，长春，130118)

高山红景天立枯病菌菌丝融合群鉴定及药剂敏感性1)

白庆荣 谢昀烨 姜旭宇 孙慧颖 高 洁

(吉林农业大学，长春，130118)

采用组织分离法从吉林省临江市、安图县罹病高山红景天植株分别获得4、2个致病菌株。病菌的形态学特征、培养性状、细胞核染色、菌丝融合及rDNA-ITS区序列测定结果表明：6个菌株均为茄立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)，属多核丝核菌；临江分离物J1～J4为AG-4-HGⅡ菌丝融合群，安图分离物J5～J6为AG-1-IB菌丝融合群。19种杀菌剂对2个菌丝融合群的敏感性测定结果表明：2个菌丝融合群对蜡质芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、井冈·蜡芽菌的敏感性最好(EC50<0.005 mg/L)；对多粘类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(强尔)的敏感性次之(EC50<1.0 mg/L)；对木霉菌和寡雄腐霉的敏感性略低(1.0 mg/L

景天立枯病；病原鉴定；菌丝融合群；药剂敏感性

高山红景天(RhodiolasachalinensisA. Bor)是景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiala)的多年生草本植物，又名库页红景天。主要分布在日本、俄罗斯、中国和朝鲜。在我国，主要分布在东北长白山区、大兴安岭及黑龙江省东部山区海拔1 700 m以上的高山冻原带和岳桦林带。高山红景天素有“高原人参”和“雪山仙草”之称，全株均可入药，以根和根茎入药为主[1]。其有效成分红景天甙，具有抗衰老、抗缺氧、抗疲劳、抗辐射、抗肿瘤、抗病毒、增强脑机能、改善心肌等功能[2]。随着吉林省北药基地的建立，高山红景天的人工栽培面积逐年加大。由于生境的改变，在栽培过程中受到很多病害的严重威胁，景天立枯病即为其中之一。2010年7月，在吉林省临江市利生源药业有限公司的高山红景天基地病害发生严重时可造成红景天苗床近70%幼苗死亡，严重威胁着景天的生产。2011年7月，吉林省安图县二道白河林场长白山科学研究院实验基地的高山红景天也遭到立枯病的严重危害，发病率近80%，损失严重。本研究对采自吉林省临江市、安图县的病株进行了病原菌分离和鉴定，同时对病菌药剂敏感性进行了研究，以期为病害综合防治措施的制定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

病害样品分别采自吉林省临江市利生源药业有限公司的红景天基地(2010年7月)和安图县二道白河林场长白山科学研究院实验基地(2011年7月)。

1.2 方法

1.2.1 症状观察

在吉林省临江市利生源药业有限公司的红景天基地和安图县二道白河林场长白山科学研究院实验基地中的高山红景天苗圃地进行病害调查，拍照记录病害发生的症状特点及危害情况。

1.2.2 菌株的分离与纯化

采用组织分离法对采自临江和安图的景天立枯病植株的茎段进行病菌的分离。用刀片切取罹病植株茎段组织若干块，在0.1%升汞中消毒0.5 min。用无菌水冲洗3次，置于水琼脂平板培养基上，每皿2～4块[3]，在恒温培养箱中25 ℃培养。待长出菌丝后，取菌丝尖端进行转板纯化，得到纯培养。

1.2.3 致病性测定

将每个纯化的菌株接种在PDA平板上培养3 d后，取直径8 mm的菌饼贴在当年生健康景天植株的茎基部(接种部位用无菌手术刀轻微划伤)，用保鲜膜将接种部位包严，以接无菌PDA培养基为对照，每个菌株及对照分别接种20株。置温室中20～25 ℃塑料袋保湿培养72 h。每天观察并记录发病情况。

1.2.4 病菌的培养学性状观察

将确定有致病性的菌株接种到PDA平板上，25 ℃恒温培养，3 d后，逐日观察培养基上的菌落形态，7 d后观察培养基上的菌核形态。

1.2.5 细胞核染色

用解剖针在菌落边缘挑一小块菌丝，放在载玻片上，滴上清水，在显微镜400×的镜头下用接目测微尺测量菌丝直径，每个菌株随机测量50处。采用番红O-KOH染色法对供试菌株进行细胞核染色，确定细胞核数目[4]。

1.2.6 病原菌菌丝融合群的测定

菌丝融合群测定所用的标准菌株为日本系统的AG-1～AG-5的代表菌株。采用常规玻片对峙培养法进行供试菌株菌丝融合鉴定。在超净工作台内，将灭菌载玻片置于灭菌融化的2%的水琼脂中浸后取出，平移入培养皿，水琼脂成一薄层凝固在载玻片上。培养皿内加2～4 mL灭菌水保湿。挑取标准菌丝融合群于载玻片正中，两侧间隔1.5～2.0 cm处置同一待测菌株，每菌株做3片，共6个重复。把载玻片放入培养皿中，在25 ℃下培养。待2菌落前缘在玻片中央相遇并交叠2～3 mm后(12～24 h)，取出玻片，镜检[5]。

1.2.7 病原菌rDNA-ITS区序列分析

以CTAB法[6]提取菌株基因组DNA为模板，ITS4/ITS5为引物进行PCR扩增。扩增的产物送至上海生物工程有限公司纯化并测序，并将测序所得的rDNA-ITS序列递交GenBank并与GenBank中的核酸数据库中的ITS区相关序列进行同源性比较。

1.2.8 病原菌的药剂敏感性测定

供试菌株：J1(AG-4-HGⅡ)，J5(AG-1-IB)。供试药剂种类及生产单位见表1。

表1 供试药剂种类及生产单位

采用菌丝生长速率法，测定供试菌株对不同种类不同质量浓度药剂的敏感性。每种药剂配制成质量浓度分别为1×103、1×102、1×10、1、1×10-1、1×10-2mg·L-1的含药平板。将在PDA平板中活化扩繁的菌种用打孔器打取直径为8 mm的菌饼，菌丝面朝下接种于含药平板中央，每个质量浓度3次重复。置于恒温培养箱内25 ℃培养72 h后，采用十字交叉法测量供试病菌在含药培养基上的菌落直径，记录数据，与对照比较计算各药剂处理对病菌的生长抑制率。查机率值与死亡率(抑制率)换算表，用最小二乘法建立毒力回归方程，计算出各药剂对病原菌的有效中浓度(EC50)，比较病原菌对各种药剂的敏感程度。抑制率=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-菌饼原始直径)×100%[7]。

2 结果与分析

2.1 病害症状观察

景天立枯病主要危害景天茎基部，发病初期茎基部有褐色病斑，随着植株的生长病斑逐渐扩展，病斑绕茎一周后，病部明显缢缩，病斑上部植株生长明显衰弱，若湿度大时，病斑继续纵向发展，延伸到叶片，受害叶片呈成水烫状，湿腐，病茎呈褐色至深褐色坏死。有时病部出现隐约的轮纹，病斑上密生灰白色菌丝，逐渐集聚成团，最后形成褐色菌核，受害植株根部腐烂，极易拔出，最终植株大量死亡(图1)。

图1 景天立枯病症状

2.2 病原菌的分离与纯化

采用组织分离法在临江市利生源药业有限公司的红景天基地采集的病害标本获得了4个培养性状基本一致的纯化菌株；在安图县二道白河林场长白山科学研究院实验基地采集的病害标本获得了2个培养性状基本一致的纯化菌株，在PDA斜面培养基上保存，使用时转至PDA平板培养基上活化。

2.3 纯化菌株的致病性测定

6个纯化菌株致病性测定结果显示：接种的植株保湿3 d后开始表现症状，发病率达100%，接种发病症状与田间病害症状一致，对照植株未见异常。从接种发病植株上分离到的病原菌，其形态与田间发病植株上分离到的相同，证明分离纯化得到的菌株均为该病害的病原菌。

2.4 病原菌的培养性状及形态学鉴定

临江代表菌株J1、J2、J3、J4菌丝体无色，菌落平铺，后逐渐变褐色，呈同心轮纹状。培养4 d后菌丝体开始纠结成白色菌丝团，成熟后变成褐色菌核(图2A)。菌丝近直角分枝，分枝处明显缢缩，不远处有一隔膜，菌丝直径较宽，大小为7.46～12.16 μm，细胞核数目4～13个(图2C-D)。安图代表菌株J5、J6菌丝体无色，呈放射状平铺培养基表面，培养4 d后形成褐色菌核(图2B)。菌丝近直角分枝，分枝处明显缢缩，不远处有一隔膜，菌丝直径大小为3.55～10.91 μm，细胞核数目5～15个(图2C-D)。根据形态学特点鉴定临江和安图两地的菌种均可能为茄立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)，属多核丝核菌。

图2 景天立枯病菌培养学性状、菌丝形态及细胞核染色

2.5 菌丝融合群的测定

采用常规玻片法进行供试菌株菌丝融合鉴定。供试菌株J1与AG-4-HG Ⅱ标准菌株发生融合(图3A)，表明供试菌株为立枯丝核菌AG-4-HG Ⅱ亚群的成员；J5与AG-1-IB标准菌株发生融合(图3B)，表明供试菌株为立枯丝核菌AG-1-IB亚群的成员。

图3 菌丝融合

2.6 rDNA-ITS区序列分析

以ITS4和ITS5为引物，对菌株J1的rDNA-ITS区进行PCR扩增。J1、J2、J3、J4扩增结果均为715 bp的DNA片段(GenBank accession FR878087)，与GenBank中的AG-4-HGⅡ亚群(GenBank accession JX843820，HQ629873)的序列相似性为100%。菌株J5、J6的rDNA-ITS区PCR结果均为631 bp的DNA片段与GenBank中的AG-1-IB亚群YMK060(Gen-Bank accession FJ440191)的序列相似性为100%，进一步验证了形态学鉴定的正确性。

2.7 菌丝融合群对杀菌剂的敏感性

引起景天立枯病的立枯丝核菌AG-4-HGⅡ和AG-1-IB菌丝融合群对7种生物杀菌剂和12种化学农药的敏感性存在差异(表2)。2个菌丝融合群对蜡质芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(稳稻)、井冈·蜡芽菌的敏感性最好，其EC50<0.005 mg/L；对多粘类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(强尔)的敏感性次之，EC50<1.0 mg/L；对木霉菌和寡雄腐霉的敏感性略低，1.0 mg/L

表2 菌丝融合群对19种药剂的敏感性

3 结论与讨论

从吉林省临江市利生源药业有限公司红景天基地罹病高山红景天植株分离到4个有致病性的菌株。从安图县二道白河林场长白山科学研究院实验基地罹病高山红景天植株中获得2个有致病性的菌株。病菌的形态学特征、培养性状、细胞核染色、菌丝融合及rDNA-ITS区序列测定结果表明：分离到的病菌为茄立枯丝核菌，属多核丝核菌，J1～J4为AG-4-HGⅡ菌丝融合群；J5～J6为AG-1-IB菌丝融合群。李熙英、黄世臣等[8-9]报道了吉林省和龙市红景天基地苗圃发生的立枯病病原为茄立枯丝核菌，并对病菌的生物学特性进行了研究，尚未对病菌的菌丝融合群进行鉴定。2012年笔者首次报道了吉林省临江市高山红景天立枯病由AG-4-HGⅡ菌丝融合群引起[10]。本研究将从吉林省临江市、安图县采集到的2个引起高山红景天立枯病的菌丝融合群进行比较研究，在其它地区是否存在更多的菌丝融合群可引起高山红景天立枯病还有待于探究。

2个菌丝融合群对生物制剂蜡质芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(稳稻)、井冈·蜡芽菌的敏感性最好；对多粘类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(强尔)的敏感性次之；对木霉菌和寡雄腐霉的敏感性略低。2个菌丝融合群对化学杀菌剂肟菌·戊唑醇、氟硅唑、腐霉利、多菌灵敏感性较高；对异菌脲和菌核净的敏感性次之；对氟菌唑、百菌清和咪鲜胺的敏感性略低。不同菌丝融合群对相同杀菌剂的敏感性基本一致，对个别杀菌剂的敏感性存在差别。2个菌丝融合群对咯菌腈、噁霉灵、嘧霉胺的敏感性存在差异，AG-1-IB菌丝融合群对这3种杀菌剂较为敏感，而AG-4-HGⅡ菌丝融合群对这3种杀菌剂的敏感性较差。这与蒙姣荣等[11]对广西玉米纹枯病的菌丝融合群的敏感性的研究结果有相似之处。

总体上看，2个菌丝融合群对生物杀菌剂的敏感性更高。笔者认为与试验中选用了营养丰富的PDA培养基利于促进生防菌的自身生长，进而增加其抑菌效果有关。生物杀菌剂能否在病害防治过程中表现出良好的防治效果，还需进一步的田间药效试验。综合评价室内试验中对病菌具有良好抑制作用的生防药剂，为指导生产奠定基础。

[1] 周荣汉.中药资源学[M].北京:中国医药科技出版社,1993:278-286.

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[5] 黄江华,周而勋,戚佩坤.广州地区13种作物丝核菌的鉴定[J].华南农业大学学报:自然科学版,2003,24(4):24-27.

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[7] 慕立义.植物化学保护研究方法[M].北京:中国农业出版社,1994:71-82.

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Anastomosis Group Identification and Susceptibility to Fungicides onRhodiolasachalinensisDamping off in Jilin Province/

Bai Qingrong, Xie Yunye, Jiang Xuyu, Sun Huiying, Gao Jie(Jilin Agricultural University, Changchun 130118, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(1).-107～111

Rhizoctoniasolanidamping off; Pathogen identification; Anastomosis group; Susceptibility

白庆荣，女，1975年11月生，吉林农业大学农学院，副教授。

高洁，吉林农业大学农学院，教授。E-mail：jiegao115@126.com。

2013年4月15日。

S435.672

1) 吉林省自然科学基金(20101565)。

责任编辑：程 红。

Six isolates with pathogenicity were obtained from the stems of diseased plants with tissue isolation method (four isolates from Linjiang City and two isolates from Antu County). The experiment was conducted to investigate their characteristics of morphology and cultivation.RhizoctoniasolaniKühn is the pathogen of the disease. Anastomosis groups are determined to be AG-1-IB subgroup in Antu and AG-4-HGⅡsubgroup in Linjiang by pairing isolates with tester trains and sequence analysis of rDNA-ITS region. By fungicides susceptibility test, two anastomosis groups are most sensitive toBacilluscereus,B.subtilis(1011/g), Validamycin·B.cereus(EC50<0.005 mg/L) followed byPaenibacilluspolymyxa,B.subtilis(108/g)(EC50<1.0 mg/L),TrichodermaandPythiumoligandrum(1.0 mg/L