蔡 乐，白 林，徐风华，任 韡，王欢欢（解放军总医院药品保障中心，北京 100853）

薄荷苯酚软膏为《中国人民解放军医疗机构制剂规范》（2002年版）中收载的皮肤科外用制剂，由苯酚、薄荷脑、凡士林和羊毛脂组成，具有止痒、消毒的作用，临床中可用于瘙痒性皮肤病、银屑病、神经性皮炎等疾病。苯酚是薄荷苯酚软膏中的主要成分，《中国药典》（2010年版）中苯酚原料药的含量测定方法为溴量法[1]，《中国人民解放军医疗机构制剂规范》（2002年版）中该制剂苯酚含量测定方法为紫外分光光度法[2]。因软膏基质的影响，用上述方法测定时，操作繁琐，测定结果易受提取等因素的干扰。为更好地控制该制剂的质量，本研究对薄荷苯酚软膏中苯酚的测定方法进行改进，建立HPLC法测定薄荷苯酚软膏中苯酚的含量。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪（包括1200系列在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、VWD检测器、色谱工作站，美国Agilent公司）；AG-285型电子天平（瑞士Mettler公司）；KQ-2200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

薄荷苯酚软膏（本院自制，批号20130515-1、20130515-2、20130515-3）；苯酚（重庆西南制药二厂有限责任公司，批号1209004）；甲醇为色谱纯；乙醇为分析纯；水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（60∶40）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：271 nm；柱温：45 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取苯酚约9.0 g，精密称定，置于200 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含苯酚45 mg的储备液A。精密移取2 mL储备液A置于100 mL量瓶中，加流动相定容，摇匀，制成每1 mL含苯酚900 μg的储备液B。精密移取1 mL储备液B置于25 mL量瓶中，加流动相制成每1 mL含苯酚为36 μg的对照品溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取供试品约0.5 g（含苯酚约5 mg），精密称定，用80 ℃的无水乙醇将其软化并转移至50 mL量瓶中，加无水乙醇适量，于60 ℃下超声15 min（功率660 W，频率28 kHz），放至室温用无水乙醇稀释至刻度，揺匀，置于冰浴中冷却2 h，取出后迅速滤过，放至室温，取续滤液10 mL置25 mL 量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液 另按处方比例及制备工艺，配制不含苯酚的空白制剂，依供试品溶液制备方法提取制备，作为阴性对照溶液。

2.3 系统适用性实验

分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液按“2.1”项下色谱条件，各进样10 μL，考察供试品中苯酚和其他组分色谱峰分离情况。在此色谱条件下，苯酚的保留时间为4.8 min，苯酚色谱峰峰形对称尖锐，基线平稳，与其他色谱峰分离良好，阴性对照在相应位置上无干扰峰。具体见图1。

图1 薄荷苯酚软膏的HPLC色谱图A-对照品，B-供试品，C-阴性对照；1-苯酚Fig 1 HPLC chromatograms of menthol-phenol ointmentA-reference substance, B-sample, C-negative reference substance;1-phenol

2.4 线性关系考察

精密吸取适量储备液B，加流动相配制成含苯酚浓度为9、18、36、72、180、360 μg·mL-1的标准溶液。分别精密吸取各浓度标准溶液10 μL，按上述色谱条件进行测定。以峰面积为纵坐标（Y），标准溶液浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，得苯酚的回归方程为Y=9.266X+ 5.983，r= 0.999 9。结果表明，苯酚在9 ～360 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.5 精密度实验

取“2.2.1”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次测定，计算苯酚的峰面积RSD（n= 6）为0.70%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验

取同一供试品（批号20130515-1）约0.5 g，共6份，精密称定，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算含量RSD（n= 6）为0.33%，表明方法重复性良好。

2.7 稳定性考察

取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、1、3、6、9、12 h进样10 μL测定，计算苯酚的峰面积RSD为0.33%（n= 6），表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.8 加样回收率实验

取6份已知苯酚含量的薄荷苯酚软膏（批号20130515-3），每份约0.5 g，精密称定，每份分别精密加入含苯酚浓度为900 μg·mL-1的溶液5 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定苯酚的含量，并计算加样回收率。苯酚的平均回收率为100.2%，RSD为0.68%，详见表1。

表1 加样回收率实验.n = 6Tab 1 Results of recovery test.n = 6

2.9 样品含量测定

取3批样品（批号20130515-1、20130515-2、20130515-3），每批3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以外标法计算各个样品中苯酚的含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 苯酚含量测定方法的选择

苯酚的含量测定方法主要有溴量法[1]、紫外分光光度法[2-4]、毛细管气相色谱法[5]以及高效液相色谱法[6-8]等。由于薄荷苯酚软膏处方中羊毛脂和薄荷脑对于溴量法测定苯酚有干扰[3]；凡士林和羊毛脂在271 nm波长下有吸收，直接采用紫外分光光度法测定苯酚会造成干扰。因此，《解放军医疗机构制剂规范》（2002年版）其含量测定时将本品经石油醚溶解后，在氢氧化钠溶液中多次萃取，将苯酚碱化为苯酚钠后进行测定，操作繁琐、费时，且易因乳化而造成损失，影响结果的重现性。毛细管气相色谱法对仪器要求较高，而采用HPLC法则可避免基质对测定的干扰，专属性强，且仪器较为普及，适用于医疗单位对该制剂的质量控制。但由于软膏基质凡士林和羊毛脂黏度大，成分复杂，样品处理不当易造成色谱柱堵塞损坏色谱柱。为此，本研究在参考文献基础上，对提取条件进行了优化。

表2 薄荷苯酚软膏中苯酚的含量.n = 3Tab 2 Contents determination of phenol in menthol-phenol ointment.n = 3

3.2 样品处理方法的优化

通过对样品的提取溶剂进行考察，本研究发现无水乙醇的提取率明显高于流动相，但使用无水乙醇提取后，提取液用流动相稀释会析出白色沉淀，直接进样易损坏色谱柱。因此，本研究在样品提取后，利用冰浴使辅料沉淀，滤过后加入流动相稀释，再用0.22 μm微孔滤膜滤过后进样，以减小供试品对色谱柱的损害[7-10]。实验发现，60 ℃水浴时充分振摇可完全提取样品，由于60 ℃超声提取方法相对简便且重现性更好，故采用60 ℃超声处理作为本实验的提取方法。

常温时薄荷苯酚软膏黏度大，精密取样后，较难转移至容量瓶中，易造成样品损失。经实验，80 ℃的无水乙醇可将基质软化，提高基质流动性，可使样品完全转移。综上，结果表明本方法操作简便、准确性高、重复性好，可作为薄荷苯酚软膏中苯酚含量测定的方法。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：443.

[2] 中国人民解放军总后勤部卫生部.中国人民解放军医疗机构制剂规范[S].北京：人民军医出版社，2003：172.

[3] 吕晓川，徐红，白林.薄荷酚软膏的制备与质量控制[J].解放军药学学报，2003，19（4）：306-307.

[4] 朱铁梁，杨波，郝素云.紫外分光光度法测定苯酚滴耳液的含量[J].武警医学院学报，2010，19（8）：605-606.

[5] 曾常青，邓金梅，陈家发.毛细管气相色谱法测定复方硼酸散中薄荷醇和苯酚的含量[J].现代食品与药品杂志，2007，17（3）：36-38.

[6] 崔丽.RP-HPLC法同时测定复方间苯二酚洗剂中间苯二酚和苯酚的含量[J].中国药房，2011，22（21）：2000-2001.

[7] 陈晓峰，沈花.高效液相色谱法测定消炎止痒醑中苯酚的含量[J].抗感染药学，2011，8（4）：268-270.

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