，*

（1.广西医科大学第一附属医院，广西南宁 530021；2.广西中医药大学药学院，广西南宁 530001；3.广西医科大学研究生院，广西南宁 530021）

n-3多不饱和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fattyacids，n-3 PUFA）是指第一个双键出现在碳链甲基端第3位的多双键不饱和脂肪酸，主要的n-3 PUFA包括 α-亚麻酸（α-linolenic aicd，ALA），二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA），二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）。目前保健食品市场上常见的n-3 PUFA有来源于深海鱼类脂肪的深海鱼油（主要含有EPA和DHA），和来源于植物种子油脂的ALA。不少研究报道表明[1-3]，n-3 PUFA能降低糖尿病患者血清低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和甘油三酯（triglyceride，TG）水平，对心血管疾病、糖尿病等患者有辅助治疗效果。有代谢研究报道表明，ALA在体内约有10%～20%被转换成EPA和DHA[4]。虽然ALA在体内代谢可生成EPA和DHA从而发挥类似深海鱼油的作用，但是其作用效果和机制目前研究还不够透彻。目前尚无n-3 PUFA对动物超敏C-反应蛋白（high sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）和凝血功能影响的研究报道。

本实验研究设计用普通饲料喂养SD大鼠模拟正常饮食人群，用高糖高脂饲料喂养SD大鼠模拟高糖高脂饮食人群，同时分别灌胃给予高、中、低3个剂量的ALA和深海鱼油。每7天称量1次体重，56 d后取血测量hs-CRP和凝血4项，用以考察两者对不同饲料喂养下健康大鼠体重、hs-CRP和凝血功能的影响，从而为不同饮食结构人群是否需要补充此类n-3 PUFA提供基础研究依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级健康的6周龄SD大鼠，体重（140±20）g（由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK桂2009-0002），饲养于广西中医药大学动物房：室温（25±2）℃、相对湿度（55±5）%，12/12 h光照，自由获取食物和饮水。

2.2 材料与仪器

α-亚麻酸（General Nutrition Corporation，批号：1836CM2668），深海鱼油（General Nutrition Corporation，批号：E67562），无水乙醇（分析纯），hs-CRP 测定试剂盒：长春汇力生物技术有限公司，批号：13012；凝血四项测定试剂盒：上海太阳生物技术有限公司，批号：13023；ST16 型离心机：Sorvall公司；7600 型全自动生化仪：日本Hitachi公司；CA1500全自动血凝仪：日本Sys-mex公司。

1.2 方法

1.2.1 饲料配制

饲料配制由广西中医药研究院实验动物中心完成，普通饲料采用清洁级大鼠维持饲料。高糖高脂饲料的配制处方：基础饲料粉末（63.8%），蔗糖（20%），猪油（10%），蛋黄粉（5%），胆固醇（1%），胆酸钠（0.2%）。

1.2.2 ALA和深海鱼油灌胃液的配制

别将ALA和深海鱼油软胶囊剪破，并将其中的内容物挤出，用1%的乙醇溶液配成浓度分别为60、30和15 mg/mL的溶液，摇匀后小剂量分装，-20℃冰箱保存备用。

1.2.3 动物分组

大鼠适应性静养3d～4d后，随机分为14组，每组10只，雌雄各半，分别分为：空白对照组（普通饲料喂养），高糖高脂对照组（高糖高脂饲料喂养）；普通饲料喂养的ALA高、中、低剂量组，普通饲料喂养的深海鱼油高、中、低剂量组；高糖高脂饲料喂养的ALA高、中、低剂量组，高糖高脂饲料喂养的深海鱼油高、中、低剂量组。

1.2.4 给药处理

根据上述分组情况将大鼠给予不同的饲料喂养，并每天按10 mL/kg的剂量灌胃相应的溶液一次。其中，空白对照组和高糖高脂对照组分别灌胃1%乙醇溶液，ALA高中低剂量组分别灌胃600、300和150 mg/kg的ALA，深海鱼油高中低剂量组分别灌胃600、300和150 mg/kg的深海鱼油。每7天称量一次各只老鼠的体重，根据体重调节灌胃体积，一共连续灌胃56 d。末次灌胃后当日晚禁食不禁水12 h，次日晨将大鼠用10%水合氯醛以3 mL/kg的剂量腹腔注射麻醉后，用一次性采样针进行腹腔主动脉取血，先取1.6 mL全血加入抗凝试管（已精密加入枸橼酸钠溶液（0.109 mol/L）0.2 mL的一次性采血管）中，迅速混匀；剩余全血加入普通采血试管中。将抗凝试管置离心机离心15 min（3 000r/min），分离血清，6h内测定凝血四项；将普通采血试管静置1 h后，置离心机离心10 min（30 00 r/min），分离血清，测定hs-CRP。

1.2.5 体重测定

灌胃前一天（0 d），14组大鼠分别称重，记录体重。给药处理期间，每7天称重1次，观察大鼠体重变化。

1.2.6 超敏C反应蛋白的测定

采用全自动血生化仪，参照试剂盒说明书进行测定。

1.2.7 凝血四项的测定

采用全自动血凝仪，按照试剂盒说明书测定凝血酶原时间（prothrombintime，PT）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶时间（thrombintime，TT）和纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）。

1.2.8 统计学分析

所有数据用SPSS17.0统计软件进行分析，结果以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为有显著性意义，P＜0.01为有极显著性意义。

2 结果与分析

2.1 实验动物的一般情况

实验过程中，用高糖高脂饲料喂养的大鼠因一时无法适应新的饲料，实验开始前3周的食量明显比用普通饲料喂养的大鼠要小，但第21天以后食量逐渐恢复正常，体重迅速增加。各组大鼠均无腹泻现象发生，但是灌胃ALA和深海鱼油的大鼠粪便比其他组大鼠油和软。各组大鼠的其他生理状态如活动、磨牙、毛色等总体一致。由于整个实验过程历时较长（8周，56 d），在某次灌胃的过程中有可能产生导致动物死亡的因素发生（例如灌胃操作失误使灌胃液流到大鼠肺部，导致大鼠肺部感染而死亡），因此有9个实验组出现了大鼠死亡的情况。因为每组大鼠的死亡个数没有超过1个，所以对整体实验数据的统计分析不会产生影响。

2.2 n-3 PUFA对大鼠体重的影响

实验开始前，各组大鼠的体重无显著性差异。实验开始前21天，用高糖高脂饲料喂养的各组大鼠由于食量下降，体重增长速率普遍比用普通饲料喂养的各组大鼠低（P＜0.01）。从第21天开始，大鼠逐渐适应了新的饲料，食量逐渐恢复正常，而且由于高糖高脂饲料所含热量比普通饲料高，大鼠体重迅速增加。到第56天，所有用高糖高脂饲料喂养各组大鼠的体重均赶上甚至超过所有用普通饲料喂养大鼠的体重，结果见图1-4。

在用普通饲料喂养的大鼠中，灌胃了n-3 PUFA的各组大鼠，从第21天开始，体重都比空白对照组大鼠的体重增速要快。其中，灌胃深海鱼油的各组大鼠体重比灌胃ALA的各组大鼠增速更快，并且深海鱼油各剂量组间的体重增长还存在一定的量效关系，以高剂量组的体重增速最快，最终体重甚至超过高糖高脂饲料对照组大鼠的体重。结果见图1和图3。

图1 ALA对普通饲料喂养大鼠体重的影响Fig.1 Effect of ALA on rats'weight when the rats were fed by normal diet

图2 ALA对高糖高脂饲料喂养大鼠体重的影响Fig.2 Effect of ALA on rats'weight when the rats were fed by sucrose and fat rich diet

图3 深海鱼油对普通饲料喂养大鼠体重的影响Fig.3 Effect of deep-sea fish oil on rats'weight when the rats were fed by normal diet

图4 深海鱼油对高糖高脂饲料喂养大鼠体重的影响Fig.4 Effect of deep-sea fish oil on rats'weight when the rats were fed by sucrose and fat rich diet

在用高糖高脂饲料喂养的大鼠中，灌胃了n-3 PUFA的各组大鼠的体重增长曲线和高糖高脂对照组大鼠相似。结果见图2和图4。

2.3 n-3 PUFA对大鼠超敏C-反应蛋白及凝血四项的影响

和空白对照组相比，所有用普通饲料喂养大鼠的hs-CRP，都无显著性差别；所有用高糖高脂饲料喂养大鼠的hs-CRP都有升高的趋势，其中灌胃深海鱼油大鼠的hs-CRP显著性升高（P＜0.01）。和高糖高脂对照组相比，用高糖高脂喂养并灌胃深海鱼油大鼠的hs-CRP也显著性升高（P＜0.01）。结果提示：高糖高脂饲料喂养能使大鼠的hs-CRP有升高的趋势，一旦深海鱼油和高糖高脂饲料同时摄入会导致大鼠hs-CRP显著性升高。结果见表1。

表1 n-3 PUFA对大鼠超敏C-反应蛋白及凝血四项影响（x±s）Table 1 The effect of n-3 PUFA on hs-CRP and four projects of blood coagulation（x±s）

各实验组之间的PT和TT没有显著性差异。和空白对照组相比，所有用高糖高脂饲料喂养大鼠的FIB极显著性升高（P＜0.05），并且灌胃n-3 PUFA对FIB并无影响。和空白对照组相比，高糖高脂对照组的APTT有降低的趋势但无显著性意义；用高糖高脂喂养并灌胃深海鱼油大鼠的APTT降低有显著性意义（P＜0.05）。结果提示：深海鱼油和高糖高脂饲料的同时摄入会导致大鼠APTT显著性降低。结果见表1

3 讨论

在已有的临床研究报道中，n-3 PUFA的服用剂量范围非常广，从400 mg/d至16.2 g/d不等，对人类最有效的口服剂量目前还在研究当中[5-8]。本实验研究所用灌胃剂量是在参考了已报道的临床研究使用剂量，并结合GNC公司深海鱼油和ALA产品说明书的推荐剂量，最后选择了一个比较适中的临床使用剂量范围，并通过体表面积法换算得到大鼠的灌胃剂量。

结果表明，灌胃56 d n-3 PUFA能使普通饲料喂养大鼠的体重明显增加，其中深海鱼油高剂量组体重增加的效果和用高糖高脂饲料喂养大鼠导致的体重增加相当。结果提示：长期大量服用n-3 PUFA容易导致正常饮食人群发生肥胖，不应长期盲目过量服用该类保健品。

在本实验研究的灌胃剂量下，ALA灌胃56 d对两种饲料喂养大鼠的hs-CRP以及凝血四项都没有影响。目前，对ALA的研究较少，而且由于动物实验的给药剂量差别很大，使实验结果存在很大的不一致性。给药剂量不足，会导致实验结果没有显著性差异。但是如果给药剂量过大，对ALA的有效性评价也必须审慎给出结论。因为ALA在体内可以转换成EPA和DHA，在高剂量给药时，ALA显现出的效果是其本身作用产生的、还是由于转换成EPA和DHA而产生的，还有待商榷。另外一方面，过量的给药剂量即使显现一定的疗效，但在临床也不具备应用价值。目前，一种先进的小鼠模型已经被研制出来[9]，其可以抑制ALA在体内转换成EPA和DHA，这种小鼠模型将非常有助于正确评估ALA的疗效。

在本实验研究中，所有用高糖高脂饲料喂养大鼠的FIB都比空白对照组显著升高，证明高糖高脂饲料能使机体处于高凝状态；深海鱼油对普通饲料喂养大鼠的hs-CRP以及凝血四项都没有影响，但是对高糖高脂饲料喂养大鼠的hs-CRP有显著性升高的影响，同时显著性降低APTT。hs-CRP是一种由细胞因子如IL-6、TNF-a等诱导的急性时相反应蛋白，是反应进行性炎症的敏感标志物。有临床研究报道[10-12]表明，2型糖尿病患者以及糖尿病肾病患者的hs-CRP显著升高，认为hs-CRP作为一个重要的筛选指标，对于预测2型糖尿病患者并发动脉粥样硬化具有积极意义。APTT是内源性凝血系统较敏感和常用的筛选指标，FIB则是参与动脉粥样硬化形成的主要前体物质。另有临床研究报道[13-15]表明，2型糖尿病患者的PT和APTT均有明显的下降，而FIB则明显升高。本实验结果表明，大鼠同时摄入深海鱼油和富含饱和脂肪酸的高糖高脂饲料，会诱发机体进行性炎症，同时使机体处于高凝状态，易导致内源性凝血的发生，这种作用否也预示着胰岛素抵抗的增加，还有待于进一步研究确证。根据实验结果可以推测，长期高糖高脂饮食人群并不适宜补充深海鱼油，深海鱼油对高血脂及糖尿病患者的辅助治疗效果应是在杜绝高糖高脂饮食的基础上产生的。

[1] Shahidi F,Miraliakbari H.Omega-3(n-3)fatty acids in healthand disease:part1cariovasculardiseaseandcancer[J] .JournalofMedicine Food,2004,7(4):387-401

[2] Shahidi F,Miraliakbari H.Omega-3 (n-3)fatty acids in healthand disease:part 2 health effect of omega-3 fatty acids in autoimmunedisease,mental health and gene expression[J] .Journal of Medicine Food,2005,8(2):133-148

[3] 陈银基,周光宏,徐幸莲.n-3多不饱和脂肪酸对疾病的预防与治疗作用[J] .中国油脂,2006,31(9):31-34

[4] Burdge GC,Jones AE,Wootton SA.Eicosapentaenoic and docosapentaenoic acids are the principal products of alpha-linolenic acid metabolism in young men[J] .Br J Nutr,2002,88(4):355-357

[5] Yee LD,Lester JL,Cole RM,et al.Omega-3 fatty acid supplements in women at high risk of breast cancer have dose-dependent effects on breast adipose tissue fatty acid composition[J] .Am J Clin Nutr,2010,91(5):1185-1194

[6] Kim W,McMurray DN,Chapkin RS.n-3 polyunsaturated fatty acids--physiological relevance of dose[J] .Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids,2010,82(4/6):155-158

[7] Skulas-Ray AC,Kris-Etherton PM,Harris WS,et al.Dose-response effects of omega-3 fatty acids on triglycerides,inflammation,and endothelial function in healthy persons with moderate hypertriglyceridemia[J] .Am J Clin Nutr,2011,93(2):243-252

[8] Sorgi PJ,Hallowell EM,Hutchins HL,et al.Effects of an open-label pilot study with high-dose EPA/DHA concentrates on plasma phospholipids and behavior in children with attention deficit hyperactivity disorder[J] .Nutr J.2007,6:16

[9] Cho HP,Nakamura MT,Clarke SD.Cloning,expression,and nutritional regulation of the mammalian Delta-6 desaturase[J] .J Biol Chem 1999,274(1):471-477

[10] 任冬梅.血清Cys-C、CRP、IL-6检测对早期糖尿病肾病的诊断意义[J] .中华保健医学杂志,2011,13(1):48-49

[11] 王振华,龙莉娟,赵钢,等.冠心病合并2型糖尿病与血浆O－mentin-1及IL-6、hs-CRP的相关性[J] .实用心脑肺血管病杂志,2011,19(9):1451-1453

[12] 周志雄,陈虎云,周泽美.血浆超敏C反应蛋白与糖尿病的关系[J] .南华大学学报:医学版,2008,36(2):195-198

[13] 李文庆,李红燕,程云.2型糖尿病患者血脂及凝血四项与健康人的比较[J] .实用医技杂志,2010,17(9):850-851

[14] 贺岩,李芹.2型糖尿病患者脂代谢及凝血指标改变的探讨[J] .华北煤炭医学院学报,2009,11(6):798-799

[15] 韦莹慧.糖尿病人血液流变学及凝血四项检测的临床意义[J] .中国血液流变学杂志,2006,16(1):151-152