谷岱霏 胡 晓 刘 彤 赵玉田 严善春

(东北林业大学,哈尔滨,150040) (黑龙江省伊春市五营林业局) (东北林业大学)

不同生长时期东北红豆杉针叶内防御蛋白的变化1)

谷岱霏 胡 晓 刘 彤 赵玉田 严善春

(东北林业大学,哈尔滨,150040) (黑龙江省伊春市五营林业局) (东北林业大学)

为研究不同生长时期东北红豆杉(TaxuscuspidataSieb. et Zucc.)针叶内防御蛋白的变化，分别对5、7、9月份的东北红豆杉雌、雄株针叶内防御蛋白PPO、PAL、POD、CAT、TI和CI活性进行了分析。结果表明：不同生长时期东北红豆杉防御蛋白的活性差异显著(P<0.05)，除POD活性在9月份达到最高值外，PPO、PAL、CAT、TI和CI的活性均在7月份达到最高值；不同生长时期雌、雄株防御蛋白活性的变化趋势基本一致。

东北红豆杉；防御蛋白；生长时期

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(7).-48～50

We measured the activities of PPO, PAL, POD, CAT, TI and CI in the leaves of female and maleTaxuscuspidateSieb. et Zucc. in May, July and September to investigate the seasonal variations of defense protein activities in leaves. The activities of defense proteins were all significantly different among the different months (P<0.05). The activities of PPO, PAL, CAT, TI and CI all peaked in July, and the activity of POD peaked in September. The female and male tree leaves were in the same trend.

KeywordsTaxuscuspidate; Defense proteins; Seasonal variations

东北红豆杉(TaxuscuspidataSieb. et Zucc.)是常绿针叶乔木，中国一级珍稀濒危树种。东北红豆杉天然分布区非常狭窄，在国内主要集中在吉林和龙、天桥岭、汪清、珲春和黑龙江省穆棱等地[1]。野外调查结果表明，天然东北红豆杉极少受到病虫害侵染，说明其具有一定的抗病虫能力，但其抗病虫机理的研究鲜见报道，特别是从化学生态和植物生理方面研究其抗性组成的研究尚属空白。与植物组成抗虫性密切相关的防御蛋白，包括多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等防御性酶系，过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等保护性酶系以及胰蛋白酶抑制剂(TI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI)等蛋白酶抑制剂(PIs)，这些防御蛋白可以作为检验植物抗虫性的指标[2-3]。林木组成抗性受很多因素的影响，易随光照、温湿度等环境因子和植物营养、植物成熟度而变化[4]，因此，植株处于不同的生长发育时期，必然会导致其体内化学物质的相应改变。

为了研究天然东北红豆杉在春、夏、秋季节的组成抗虫特性，笔者分别测定分析5、7、9月份3个不同生长时期东北红豆杉针叶内防御蛋白的变化，以期了解防御蛋白与生长时期的关系，探寻防御蛋白在其抗虫性中的作用，为林木害虫的防控提供新理论和新思路。

1 材料与方法

1.1 植物材料

在黑龙江省南部穆棱东北红豆杉自然保护区内，在相同立地条件下，分别于5、7、9月份，选择胸径为40～50 cm(保护区内典型胸径)东北红豆杉雌、雄株各10株。在每个植株上采集树冠中部阳面当年生枝条的针叶，将从每株采到的针叶分别装入夹链袋内，迅速放入冰盒，带回实验室，冰箱中，-40 ℃保存待测。

1.2 仪器与试剂

仪器：电子天平(奥豪斯国际贸易上海有限公司)、D-37520冷冻离心机(德国)、电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)、UV-240紫外分光光度计(Biochtom Ltd.Cambridge CB4 OF J.England)。

试剂：愈创木酚、过氧化氢、浓盐酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硼酸、氯化钙为国产药品；聚乙烯吡咯烷酮(PVP40)、Triton X-100、巯基乙醇(Mer)、三羟甲基氨基甲烷(Tris-Base)、抗坏血酸(VC)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶均为AMRESCO公司产品；苯丙氨酸为WAKO公司产品；咖啡酸、苯甲酰精氨酸乙酯(BAEE)、N-苯甲酰-L-酪氨酸乙脂(BTEE)为SIGMA公司产品。

1.3 测定方法

取1 g针叶鲜样，在液氮冷冻条件下充分碾碎，低温保存备用。

防御酶活性测定：多酚氧化酶(PPO)活性测定参照刘艳的咖啡酸比色法[5]，于470 nm下测定吸光度，以1 min内OD470变化0.01的酶量为1个酶活力单位。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定参照Zong等的苯丙氨酸比色法[6]，于290 nm下测定吸光度，以1 min内OD290变化0.01的酶量为1个酶活力单位。

保护酶活性测定：过氧化物酶(POD)活性测定参照李合生的愈创木酚法[7]，于470 nm下测定吸光度，以1 min内OD470变化0.01的酶量为1个酶活力单位。过氧化氢酶(CAT)活性测定参照王晶英等的过氧化氢氧化法[8]，于240 nm下测定吸光度，以1 min内OD240变化0.1的酶量为1个酶活力单位。

蛋白酶抑制剂活性测定：胰蛋白酶抑制剂(TI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI)活性测定参照徐伟的方法[9]，分别于256和253 nm下测定吸光度，以1 min内蛋白酶抑制剂活力降低0.001的酶量为1个酶活力单位。

1.4 数据处理

使用SPSS 17.0软件，采用One-Way ANOVA分析不同生长时期内东北红豆杉针叶内防御蛋白变化的影响，多重比较采用LSD法。

2 结果与分析

2.1 防御酶活性随生长时期的变化

东北红豆杉针叶内PPO活性，在5、7、9月份之间的差异显著(P<0.05)，5和9月份显著低于7月份(P<0.05)(表1)。雌、雄株针叶内PPO活性的变化趋势和差异显著水平保持一致，且均在7月份达到最高值。7月份PPO活性雄株约为雌株的2倍。东北红豆杉针叶内PAL活性，在不同月份中差异均显著(P<0.05)，5月份显著低于7月份和9月份(P<0.05)；7月份和9月份之间酶活性差异较与5月份的小，差异显著(P<0.05)。雌、雄株针叶内PAL活性非常接近，且均在7月份达到最高值，变化趋势和差异显著水平保持一致(表1)。

表1 不同生长时期东北红豆杉针叶内防御蛋白活性 U·g-1

月份CAT雌株雄株TI雌株雄株CI雌株雄株5(0.0016±0)c(0.0024±0)c(47.015±1.281)b(36.450±1.293)b(92.992±6.266)c(91.392±8.427)c7(0.0076±0.001)a(0.0039±0.001)a(78.065±2.667)a(91.290±2.581)a(247.841±19.456)a(171.582±18.478)a9(0.0034±0.001)b(0.0031±0)b(32.419±1.965)c(25.290±1.302)c(137.939±16.927)b(113.024±11.234)b

注：表中数据为平均值±标准差，同列中不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2 保护酶活性随生长时期的变化

东北红豆杉针叶内POD活性，在不同月份中差异均显著(P<0.05)，9月份显著高于5和7月份(P<0.05)。雌、雄株针叶内POD活性均在9月份达到最高值，但在5和7月份雌、雄株变化趋势不同，其中雌株7月份显著高于5月份，而雄株5月份显著高于7月份(表1)。CAT活性，在5、7、9月份之间的差异显著(P<0.05)，5月份显著低于7和9月份(P<0.05)(表1)。雌、雄株针叶内CAT活性的变化趋势和差异显著水平保持一致，且均在7月份达到最高值。7月份CAT活性雌株约为雄株的2倍。

2.3 蛋白酶抑制剂活性随生长时期的变化

东北红豆杉针叶内TI活性，在不同月份中差异均显著(P<0.05)，7月份最高，5月份次之、9月份最低。雌、雄株针叶内TI活性的变化趋势和差异显著水平保持一致，且均在7月份达到最高值。7月份TI活性雌株略低于雄株，5和9月份雌株略高于雄株(表1)。CI活性，在5、7、9月份之间差异显著(P<0.05)，CI活性由高至低依次为7月份、9月份、5月份(表1)。雌、雄株针叶内CI活性的变化趋势和差异显著水平保持一致，且均在7月份达到最高值。

3 结论与讨论

在长期的协同进化过程中，植物和昆虫及病原体不断相互作用，彼此形成了许多防御及适应机制，因此植物自身起防御作用的物质会随植物的生长时期的不同做出相应的调整从而应对病虫害的发生期[10]。本研究表明，在不同生长时期东北红豆杉针叶内防御蛋白的活性变化差异显著(P<0.05)，PPO、PAL、CAT、CI的活性由高到低依次为7月份、9月份、5月份(P<0.05)，TI的活性为7月份、5月份、9月份(P<0.05)；5种防御蛋白活性均在7月份达到最高值，且雌、雄株的变化趋势和差异显著水平保持一致。但不同的是，POD活性在9月份达到最高值。本研究证明：东北红豆杉的防御机制可以有效适应病虫害的发生期，即在不同生长时期叶内防御蛋白活性的变化与东北地区病虫害大发生时期的变化趋势相同。例如，东北地区舞毒蛾5月上旬开始孵化，7月上旬发育至取食量最大的6龄幼虫[11]；东北红豆杉的防御蛋白活性也从5月进入上升期，7月达到最大值。这种有效分配防御物质应对病虫害的防御机制是野生东北红豆杉很少遭受病虫害的原因之一。

与石蕾等[12]的研究结果比较发现，同时期的东北红豆杉针叶内防御蛋白活性显著高于落叶松针叶内防御蛋白活性。东北红豆杉中除防御蛋白外，还存在其他重要的次生防御物质以抵抗病虫害侵袭。胡晓等[13]研究表明，紫杉醇和三尖杉宁碱都具有对舞毒蛾幼虫的拒食活性。常醉等[14]研究表明，随着营养时期的变化，东北红豆杉枝中紫杉醇和三尖杉宁碱含量从4月份到10月份整体呈先上升后下降并趋于稳定的变化趋势；7月份东北红豆杉防御蛋白和两种紫杉烷类物质的含量均高于5月份和9月份，有利于抵抗病虫害的侵袭。这也从生理生化角度解释了东北红豆杉很少遭受昆虫侵袭的原因。

本研究表明，7月份东北红豆杉针叶内CAT、CI的活性雌株显著高于雄株，PPO的活性雄株显著高于雌株；雌、雄株侧重利用不同的防御蛋白发挥防御功能，说明东北红豆杉雌、雄株应对病虫害可能采取不同的防御策略。

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Seasonal Variations of Defense Protein Activities inTaxuscuspidateLeaves/

Gu Daifei, Hu Xiao, Liu Tong(Northeast Foestry University, Harbin 150040, P. R. China ); Zhao Yutian(Forestry Bureau of Wuying, Yichun, Heilongjiang); Yan Shanchun(Northeast Forestry University)//

1) 国家自然基金项目(30870464)。

谷岱霏，女，1991年1月生，东北林业大学林学院，硕士研究生。

严善春，东北林业大学林学院，教授。E-mail：yanshanchun@126.com。

2014年3月5日。

S791.49

责任编辑：程 红。