盛丹丹，李楠，叶振南，王文君

（江西农业大学江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西南昌330045）

“黄金茶”是蜡梅科植物，学名为柳叶蜡梅，半常绿灌木，盛产于浙江西部的开化，淳安及江西东北部的玉山等县市，尤其是在三清山及其周边一带海拔三百到一千五百米的山麓分布最多。黄金茶是山茶，优于苦丁茶，是纯天然有机绿色保健饮品，该茶色泽翠绿，香气高雅，一般生长在陡峭的峭壁岩石上。经国家有关科研单位测定，黄金茶中含挥发油、生物碱、黄酮类等多种有效性成分。现代医学研究认为：黄金茶有抗菌消炎，抗病毒作用，并有较好的降脂、健脑、减肥、醒酒之良效。常饮黄金茶，能调节人体机能，增强体质，延缓衰老，提高抗病能力，这些可能与其含有的生物活性成分有关[1-4]。

黄酮类化合物又称为黄酮体、黄碱素，是在植物界中广泛分布的一类成分[5]。黄酮类化合物具有降血糖、降血脂等作用，同时它还是一种天然的抗氧化剂，具有清除人体中超氧离子自由基、抗衰老、增强机体免疫力的生理活性[6]。目前，有关黄金茶中黄酮类化合物的研究尚鲜见报道，因此本试验对黄金茶中总黄酮的超声提取工艺进行了研究，以总黄酮的含量为指标，采用分光光度法进行测量，并运用正交试验的方法对相关工艺参数进行优化，确定最佳的提取条件，以期为黄金茶中黄酮类化合物的开发利用提供理论依据。黄酮类化合物易溶于甲醇、乙醇、氯仿等极性溶剂，在510 nm处可见光谱带吸收较强。但由于甲醇毒性大、易挥发；氯仿有剧毒，且使用没有乙醇方便、安全，因此本试验选用乙醇作为提取溶剂。

1 材料与方法

1.1 材料及主要仪器

1.1.1 试验原料

黄金茶：购自江西省玉山县黄金茶厂。

1.1.2 主要试剂

无水乙醇（分析纯）；芦丁（≥95.0%）：上海润捷化学试剂有限公司；亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠均为分析纯。

1.1.3 主要仪器

104-4-BS型电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械厂；FLB-100型万能高速粉碎机：上海菲力博食品机械有限公司；YP600型电子天平：上海精科天平有限公司；KQ3200DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；WFJ2100型可见分光光度计：尤尼柯上海仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理

将黄金茶用粉碎机粉碎，过70目筛，在电热恒温干燥箱中60℃下干燥15 h后放于干燥器中备用。

1.2.2 标准曲线的制作

根据参考文献[7-9]，精确称取60℃下烘干至恒重的芦丁标准品10 mg于小烧杯中，加适量70%的乙醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，摇匀，即为0.4 mg/mL的标准溶液。精确吸取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 的标准溶液，分别置于6个25 mL容量瓶中，加5%的亚硝酸钠0.3 mL，放置6 min，再加10%的硝酸铝0.3 mL，放置6 min，最后加4%的氢氧化钠4 mL，用70%的乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min后用可见分光光度计在510 nm处测定吸光度。根据实验数据，可得回归方程：A=6.832 1c-0.018 5，R2=0.998 6，标准曲线的线性范围为0.008 mg/mL～0.048 mg/mL。以各标准溶液的浓度为横坐标，以测得的相应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 The standard curve of rutin

1.2.3 黄金茶中总黄酮得率的测定

准确称取黄金茶粉末0.5 g于50 mL三角瓶中，加入定量一定浓度的乙醇溶液，在一定超声功率下，超声一定时间，将提取液转移至50 mL容量瓶中，用相应浓的乙醇定容至刻度，摇匀，过滤。准确吸取1 mL滤液于25 mL容量瓶中，按照标准曲线中的显色方法显色，测定吸光度，根据回归方程，计算总黄酮的含量，得出得率：

总黄酮得率（%）=（c×25×50×100%）/（m×1 000）

式中：c为0.5 g黄金茶粉末经乙醇提取后所得黄酮的浓度；m为黄金茶粉末的质量。

1.2.4 单因素及正交试验

本试验通过对提取工艺中超声时间（A）、超声功率（B）、乙醇浓度（C）、料液比（D）4个影响黄金茶中总黄酮得率的主要因素进行单因素试验及正交试验，确定最佳的工艺参数。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果及分析

2.1.1 不同超声时间对黄金茶总黄酮得率的影响

准确称取0.5 g黄金茶粉末于50 mL三角瓶中，加入70%的乙醇10 mL（即料液比1∶20），超声功率为120 W 的条件下，分别作用 10、15、20、25、30 min，然后转移至50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，摇匀后过滤。分别取滤液1 mL于25 mL容量瓶中，按照标准曲线中的显色方法显色，测定吸光度，计算总黄酮得率见图2。

图2 超声时间对黄金茶中总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on extraction ratio of flavonoids compounds

如图2所示，总黄酮的得率随超声时间的延长先增大后减小，原因是时间过短，黄酮物质还未充分溶出，20 min时黄酮物质充分溶出以达到平衡，再延长时间，黄金茶中其他杂质也溶出到提取液中，可能对黄酮的检测有一定影响，而且黄酮易于氧化，有效成分可能随时间延长而减少[10-11]，所以应该选择提取时间20 min左右。

2.1.2 不同超声功率对黄金茶总黄酮得率的影响

准确称取0.5 g黄金茶粉末于50 mL三角瓶中，加入70%的乙醇10 mL（即料液比1∶20），分别在功率60、75、90、105、120、135 W 条件下，作用 20 min，然后转移至50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，摇匀后过滤。分别取滤液1 mL于25 mL容量瓶中，按照标准曲线中的显色方法显色，测定吸光度，计算总黄酮得率见图3。

图3 超声功率对黄金茶中总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction ratio of flavonoids compounds

如图3所示，随超声功率的增大，黄酮得率先增大后减小又增大，功率在75 W时得率最大，黄酮得率变化趋势的原因还有待进一步的研究。考虑到节约能源，选择超声功率在75 W左右。

2.1.3 不同乙醇浓度对黄金茶总黄酮得率的影响

准确称取0.5 g黄金茶粉末于50 mL三角瓶中，分别加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇 10 mL（即料液比1∶20 g/mL），在功率75 W条件下，作用20 min，然后转移至50 mL容量瓶中，用相应浓度的乙醇定容至刻度，摇匀后过滤。分别取滤液1 mL于25 mL容量瓶中，按照标准曲线中的显色方法显色，测定吸光度，计算总黄酮得率见图4。

图4 乙醇浓度对黄金茶中黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction ratio of flavonoids compounds

如图4所示，乙醇浓度小于70%时，黄酮得率逐渐增大，达到70%之后得率开始下降，而且在乙醇浓度达到90%时，黄酮得率明显下降。原因可能是不同浓度的乙醇其极性不同，溶解的物质性质不同。随乙醇浓度的的增大，一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加，这些成分与黄酮类物质竞争同乙醇—水分子结合，从而导致黄酮得率下降[12]。选择乙醇浓度70%左右为宜。

2.1.4 不同料液比对黄金茶总黄酮得率的影响

准确称取0.5 g黄金茶粉末于50 mL三角瓶中，分别加入 70%的乙醇 5、7.5、10、12.5、15 mL（即料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30），在功率 75 W 条件下，作用20 min，然后转移至50 mL容量瓶中，用70%的乙醇定容至刻度，摇匀后过滤。分别取滤液1 mL于25 mL容量瓶中，按照标准曲线中的显色方法显色，测定吸光度，计算总黄酮得率（图5）。

图5 料液比对黄金茶中黄酮得率的影响Fig.5 Effect of material to liquid ratio on extraction ratio of flavonoids compounds

料液比即是溶剂的用量，如图5所示，随着料液比的增大，黄酮得率先增大后减小，原因是料液比较小时，黄酮的有效成分不能充分溶出，随着料液比的增大，黄酮的有效成分基本溶出，再增大料液比，会造成溶剂和能源的浪费，综合考虑得率、溶剂用量和能源损耗等因素，选择料液比 1∶20（g/mL）左右为宜[13]。

2.2 正交试验

2.2.1 正交试验设计

为了综合考虑多因素相互作用对黄金茶中黄酮得率的影响，在以上但因素试验的基础上，对影响黄酮得率的主要因素：超声时间、超声功率、乙醇浓度、料液比进行L9（34）正交试验，同时对试验结果进行方差分析。对上述4个因素各取3个优化水平，因素水平设计表和正交试验设计表见表1、表2。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

2.2.2 正交试验结果分析

按上述正交设计表进行试验，结果及分析见表3。

由表3正交试验结果及极差分析正交试验结果可知，各因素对超声辅助提取黄金茶中黄酮得率影响的程度依次为乙醇浓度＞超声时间＞超声功率＞料液比（C＞A＞B＞D）。由表3方差分析表及表4 Duncan新复极差法多重比较分析可知，乙醇浓度，超声时间，均为差异极显著的因素（P＜0.01），超声功率和料液比是差异不显著因素。超声辅助提取黄金茶中黄酮的最佳提取工艺条件为A3B2C1D3，超声时间20min，超声功率75W，乙醇浓度70%，料液比1∶20（g/mL）。为了验证最佳的提取工艺，利用上述条件做了验证试验，经过3次试验取平均值得到此条件下的得率为5.350 4%，这与理论预测值相差不大。因此，利用正交试验优化得到的最佳提取工艺可靠，具有实用价值。

表2 正交试验设计表L9（34）Table 2 The design table of orthogonal experiments

表3 正交试验方案及结果分析表Table 3 The design and results of orthogonal experiments

表4 黄酮类化合物得率的方差分析Table 4 Analysis of variance of extraction ratio of flavonoids compounds

3 结论

采用单因素试验考察了4个因素（超声时间、超声功率、乙醇浓度和料液比）对黄金茶中黄酮提取得率的影响，然后对超声时间、超声功率、乙醇浓度和料液比采用L9（34）正交试验进行优化。利用DPS软件得出数据，通过极差分析和方差分析得出的合理工艺参数。从极差R值和方差分析来看，黄金茶中黄酮提取含量的影响因素主次顺序为乙醇浓度＞超声时间＞超声功率＞料液比（C＞A＞B＞D）。超声辅助提取黄金茶中黄酮的最佳提取工艺条件为A3B2C1D3，超声时间20 min，超声功率 75 W，乙醇浓度 70%，料液比 1∶20（g/mL）。

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