弓二海，刘 静

（赤峰学院附属医院，内蒙古 赤峰 024000）

瓷熔附基底冠合金细胞毒性的实验研究

弓二海，刘 静

（赤峰学院附属医院，内蒙古 赤峰 024000）

目的：通过测量五种常用瓷熔附基底冠合金浸提液对人牙龈成纤维细胞的细胞毒性，为瓷熔附基底冠合金的生产和临床应用提供实验依据.方法：体外培养人牙龈成纤维细胞，利用五种常用瓷熔附基底冠合金浸提液对人牙龈成纤维细胞进行培养，应用MTT法测定各合金浸提液内细胞的增值率.结果：镍铬合金、钴铬合金、低含金量金合金、含钛镍铬合金组与对照组和纯钛组之间差异有统计学意义（p＜0.001)；镍铬合金和钴铬合金组之间差异无统计学意义(P＞0.05)；低含金量金合金和含钛镍铬合金组之间差异无统计学意义 (P＞0.05)；镍铬合金和钴铬合金组与低含金量金合金和含钛镍铬合金组之间差异有统计学意义（P＜0.01）.结论：镍铬合金、钴铬合金、含钛镍铬合金、低含金量金合金抑制细胞增殖，含钛镍铬合金、低含金量金合金的生物相容性优于镍铬合金、钴铬合金，纯钛基本不影响细胞增殖.表明应根据合金的细胞毒性来指导新型合金的研制和临床应用.

人牙龈成纤维细胞；细胞培养；瓷熔附基底冠合金；细胞毒性；MTT法

随着瓷熔附基底冠（Porcelain-fused-to-metal crown）在临床上的广泛应用及新型合金的研制和加速发展，合金的种类以及成分都发生了变化，合金对人体产生的生物学效应也受到人们的关注.尽管国内学者对牙科铸造合金的生物相容性做了大量的研究，但由于测试方法本身的局限性和测试标准不统一，实验结果常常不一致，有时甚至得出相反的结论.目前牙科材料的细胞毒性研究常用L929鼠成纤维细胞.有研究[2]认为由于细胞系是在高生长率的条件下培养的，所以人体正常细胞可能比细胞系更耐受牙科合金材料的毒性.因此，人牙龈成纤维细胞作为牙科合金细胞毒性研究模型比已有的来源于其他动物细胞系敏感，本实验通过建立人牙龈成纤维细胞模型更能客观反映牙科材料的细胞毒性，可以为进一步认识烤瓷合金对细胞增殖的影响及其实验研究提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

镍铬合金(上海齿科材料厂，成分不详)；含钛镍铬合金（上海齿科材料厂Ti:4-6%）；纯钛（西北有色金属研究院）；低含金量金合金(美国AURIUM公司含金75.6%)；钴铬合金（上海齿科材料厂Co: 33%;Cr：30%）.

DMEN培养液（Gibco公司）；国产胎牛血清（杭州四季青生物制品有限公司）；胰蛋白酶（Gibco公司产品）；MTT(德国Merck公司产品)；二甲基亚飒（美国Sigama公司）.

图1 波形丝蛋白染色呈阳性×400

图2 抗细胞角蛋白染色阴性×200

1.2 人牙龈成纤维细胞的体外培养及鉴定

经患者同意，取临床冠延长术切取的龈缘组织（患者年龄22岁），酶消组织块法原代培养，原代培养细胞在7～10d左右开始生长融合成片,当细胞汇合达75%左右时,按1：2比例传代培养.取第二代细胞爬片倒置显微镜下观察细胞形态特征，用免疫组化ABC法进行波形丝蛋白和细胞角蛋白染色，证明其为中胚层来源的成纤维细胞(图1、2).

1.3 合金浸提液的制取

将合金制作为5.5mm×2.5mm的小圆柱，为更好地模拟临床，，试样处理与临床相符，经过高温铸造及烤瓷烧结程序.常规打磨、抛光、消毒.将金属小圆柱浸入0.5ml含培养液的小牛血清中,在培养箱中 37℃、5%CO2、湿度95%下保存，72小时后收集合金析出液.

1.4 MTT检测指标

将细胞培养液配成单细胞悬液，接种到96孔板（孔体积200ul），每孔1.0×104个细胞，在37℃、5%CO2、湿度95%条件下培养48h.用等量合金浸渍液置换培养液，每孔加MTT溶液（5mg/ml）20ul.继续孵育4小时，离心后再吸去孔内培养上清液.每孔加150ulDMSO，振荡10分钟.结晶物充分溶解后，选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，每种合金离子溶液重复10次试验.

1.5 统计学分析

用spss17.0统计学软件对五组合金和对照组的吸光值进行单因素方差分析.

2 结果

2.1 光镜观察

人牙龈成纤维细胞的形态学观察结果：贴壁生长的人牙龈成纤维细胞呈星形、棱形，细胞核为椭圆形单核；在上述5种烤瓷合金浸提液里培养4h后，细胞生长密集，其形态和核相没有发生明显的改变，各合金浸提液中培养的牙龈成纤维细胞形态差异不明显（图3）.

对五组合金和对照组的吸光度均值统计学分析表明，镍铬合金、钴铬合金、低含金量金合金、含钛镍铬合金组与对照组和纯钛组之间差异有统计学意义（p<0.01)；镍铬合金和钴铬合金组之间差异无统计学意义(P>0.05)；低含金量金合金和含钛镍铬合金组之间差异无统计学意义(P>0.05)；镍铬合金和钴铬合金组与低含金量金合金和含钛镍铬合金组之间差异有统计学意义（p<0.01).

5种合金浸提液培养细胞的OD值及OD值降低的百分比见附表.

图3 5种合金浸提液培养细胞24h倒置显微镜下观察×100

附表 五组合金和对照组的吸光度均值

3 讨论

合金析出元素在局部微环境的聚集达到超出一定浓度时，会引起局部不良反应.牙科烤瓷合金边缘位常于龈下，改变了正常的牙体形态结构，使得食物残渣易于存积且不易清洁，食物残渣发酵产酸，使其更易发生腐蚀，释放出来的金属离子首先沉积于牙龈组织中.Wataha[3]等研究发现酸性环境会增加某些合金的金属离子释放.同时烤瓷冠的颈缘是应力集中部位，合金应力疲劳后，更易发生腐蚀.析出的金属离子还可经牙周组织或消化道途径进入机体内部[4]，如达到一定浓度则对机体局部和系统产生毒性作用，研究表明[5]，较低浓度的金属离子即可引起局部毒性反应,因而烤瓷合金对牙龈的局部毒性更应该受到研究者们的关注.

研究细胞毒性作用的方法有很多，当前常用的体外实验均无法精确预测材料长期的生物学作用.尽管近年来对牙科合金生物相容性的研究报道很多，可是这些研究结果常常引起争议，不一致的实验方法常导致不同的结果.MTT比色法是通过测量线粒体内酶的变化来判定细胞的活性的.线粒体是细胞的病理变化中细胞受损最灵敏的指标，因此MTT法能够更灵敏地反映材料的细胞毒性程度[6].但细胞活性受多种因素影响，只用一种酶的活性评价材料的细胞毒性是不全面的.随着分子生物学的发展，可通过研究合金析出的金属离子对基因表达和蛋白质合成的影响来更全面的反映材料的细胞毒性机制.

统计学分析结果表明，镍铬合金和钴铬合金对细胞增殖影响最明显（Ni-Gr：1.020；Co-Cr：1.035），镍铬合金和钴铬合金之间差异无统计学意义（P>0. 05）；含钛镍铬合金和低含金量金合金次之（低含金量金合金：OD:1.137；含钛镍铬合金:OD:1.147），含钛镍铬合金和低含金量金合金之间差异无统计学意义(P>0.05）；纯钛和对照组差异无统计学意义（P>0.05），基本不影响细胞增殖.本实验结果与其他学者研究基本一致[7-9].表明临床医生要充分了解瓷熔附基底冠合金的生物学性能，在修复选择时应尽量选用生物相容性好的材料，以取得良好的修复效果.含钛镍铬合金和低含金量金合金抑制细胞增殖作用明显低于镍铬合金和钴铬合金，可能与金、钛元素改善了合金的生物性能、增加了合金的耐腐蚀性有关，研究表明含钛量在4%～6%的含钛镍铬合金可在合金表面形成氧化钛(TiO2)，TiO2钝化膜可改善合金的腐蚀性和生物相容性[2-6].这表明应使用金、钛等生物相容性较好的元素改善烤瓷合金材料力学性能、耐蚀性能及生物相容性并降低合金成本.

人牙龈成纤维细胞在5种烤瓷合金浸提液里培养24h后，未见明显的细胞形态改变.倒置显微镜下可见细胞生长密集、细胞膜完整、无明显的细胞损坏或凋亡，表明这五种合金材料均有较好的生物相容性.结合六级毒性评分标准显示5种合金的细胞毒性分级都是1级，属合格，表明尽管各种基底金属材料的细胞毒性作用存在一定的差异，但其在临床应用均具有安全性.

牙科铸造合金的生物学反应是多方面的，细胞毒性反应是合金与机体相互作用的结果，受合金本身化学成分、金相结构、腐蚀性能和机体生物学环境多方面的影响，不同个体对合金的毒性反应存在个体差异，因而在对烤瓷合金细胞毒性进行研究时，要从多方面的多种因素加以考虑，尤其在临床应用中，要对所选用的铸造合金的成分、性能、结构及可能产生的不良生物学反应具有充分的了解.本研究结果表明金合金、纯钛具有良好的生物学性

能，是牙科材料未来的发展趋势，应尽量选用，以取得最好的修复效果，逐步代替镍、铬等生物相容性差的材料.进一步研究烤瓷基底冠合金的细胞毒性作用机制，除了牙科医师的努力外，还需材料学专家、生物学专家等的参与.

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1673-260X（2014）12-0059-03