张文佳 胡竹林 朱勤 韦春玲 孙晓梅 代解杰 刘海 杨忠昆

【实验研究】

人脐静脉血管内皮细胞在体移植替代猴角膜内皮细胞的形态学分析△

张文佳 胡竹林 朱勤 韦春玲 孙晓梅 代解杰 刘海 杨忠昆

血管内皮细胞；角膜内皮细胞；恒河猴

目的 使用去除后弹力层的恒河猴自体角膜为细胞载体，将培养的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)种植到角膜内表面，观察HUVEC替代恒河猴角膜内皮细胞的功能情况以及HUVEC在恒河猴眼内生长的情况。方法 取恒河猴6只随机分为3组：实验组(3只)、实验对照组(2只)、空白对照组(1只)。实验组：用离心沉淀法将培养的HUVEC移植到去除后弹力层的恒河猴自体角膜内表面，之后将自体角膜缝回植床；实验对照组：将撕除部分后弹力层的术眼角膜植片原位缝回植床；空白对照组：取下术眼角膜植片不做任何处理原位缝回植床。术后观察各组角膜植片透明情况；实验组及实验对照组于术后30 d及60 d、空白对照组于术后60 d行术眼摘除，标本做病理切片、CD34免疫组化及扫描电镜，观察房角结构及HUVEC在角膜植片内表面形态分布。结果 实验组角膜植片维持了一定的厚度和透明性，而实验对照组角膜植片发生严重大泡性改变。病理切片示实验组角膜内表面可见一层细胞生长，CD34染色阳性，提示为血管内皮细胞；实验对照组角膜内表面未见任何细胞生长；空白对照组角膜植片保留完整后弹力层及内皮细胞层。扫描电镜示实验组有HUVEC单层在角膜内表面生长但有大量白细胞聚集及少量细胞碎片嵌顿于小梁网；实验对照组角膜内表面残留胶原纤维样物质，无细胞生长；空白对照组见完整六边形角膜内皮细胞层。结论 HUVEC能够在撕除后弹力层的恒河猴角膜内表面生长并发挥一定的屏障作用，维持角膜的厚度和透明性，但会产生较重的排斥反应。

[眼科新进展，2014，34(11)：1020-1024]

角膜内皮层的完整和功能健全是维持角膜的正常厚度及透明性的重要因素。灵长目动物(包括人类)的角膜内皮细胞(corneal endothelial cell，CEC)属于终末细胞，正常情况下无分裂能力，多种原因可导致角膜内皮受损，引起大泡性角膜病变，导致患眼疼痛乃至失明。鉴于新鲜角膜植片匮乏的现状，穿透性角膜移植术难以广泛开展，目前国内外针对角膜内皮受损治疗研究热点是角膜内皮移植术，但是CEC的来源仍然成为其制约因素。寻找有效的CEC功能替代细胞可能将成为新的研究方向。本实验利用血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)与CEC具有结构和功能上的相似性和各自的特点，直接以自体角膜基质为载体，利用人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)进行恒河猴CEC替代移植，取得了可喜的效果，为细胞替代移植开拓了新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验用成年恒河猴6只，年龄5～10岁，体质量3.0～5.0 kg，雌雄兼有，由中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所灵长类研究中心提供，实验前动物行血液、尿液、粪便三大常规检测、血生化检测、心电图监测，均为健康成年恒河猴；各实验用猴眼前段检查结膜无充血水肿、角膜透明、前房深度正常、瞳孔圆，直径3 mm、晶状体透明，均达到正常眼要求。实验用猴饲养于该中心普通动物房，分笼饲养，室温(21±5)℃，相对湿度(55±15)%，12 h明暗交替，全价营养颗粒饲养，去离子水装瓶饮用，每日添加水果。

1.2 HUVEC的制备 HUVEC细胞株用含体积分数10%胎牛血清及体积分数1%双抗的1640培养液培养传代至第三代，用1640液制备密度为 0.5×109～0.6×109L-1的细胞悬液备用。

6只恒河猴手术均于1 d内完成，术后所有动物均由中国医学科学院医学生物学研究所灵长类研究中心饲养，术后每日用妥布霉素/地塞米松眼液滴术眼2次，每日复方托吡卡胺眼液滴术眼1次。术后一周加用环孢霉素A眼液滴术眼至术后1个月。

1.4 术后观察各组角膜植片情况 术后取标本做病理切片、CD34免疫组化及电镜扫描，观察房角结构及HUVEC在角膜内表面的形态。

2 结果

2.1 HUVEC形态学观察 HUVEC为贴壁生长的细胞，且传代培养的生长速度较快，2 d就能铺满25 mL培养瓶底，细胞大致呈梭型，呈铺路石样贴壁生长(图1A)。

2.2 通过离心沉淀法种植到去除后弹力层的恒河猴角膜内表面上去的HUVEC形态学观察 倒置显微镜下恒河猴CEC呈较为规律的单层六边形结构(图1B)。去除中央后弹力层之后显微镜下角膜植片上未见残留的CEC(图1C)。制备HUVEC细胞悬液时需用胰蛋白酶将贴壁细胞消化下来，吹打后方能制成，因而原本呈梭形贴壁生长的HUVEC经过短暂的2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后，即开始疏散变圆。离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是就产生了一个向外的离心力。

因为本实验所用离心速度较低并且是渐进加速，所以对移植细胞的形态不会有很大影响而且能使细胞较均匀的贴壁，于是悬液中移植上去的HUVEC呈类圆形而非贴壁生长时呈均匀梭形分布(图1D)，移植上去的HUVEC细胞数量约为3000 mm-2。

Figure 1 Morphology observation of HUVEC.A：Human vascular endothelial cells cultured and expanded to the third generation(×200)；B：Rhesus monkey corneal endothelial cells showed single-layer hexagonal structure under inverted microscope(×40)；C：No residual corneal endothelial cells on the inner surface of cornea after the central Descemet-membrane removed(×40)；D：HUVEC on the inner surface of Rhesus monkey corneal graft by the centrifugation method(×40) HUVEC形态学观察。A：培养扩增至第三代的HUVEC(×200)；B：倒置显微镜下恒河猴角膜内皮细胞呈六边形单层分布(×40)；C：去除中央后弹力层之后的角膜植片，其上未见残留的CEC(×40)；D：通过离心沉淀法种植到恒河猴角膜内表面的HUVEC(×40)

2.3 移植后角膜透明性和前房深度的观察 术后3 d，实验组角膜植片透明度较好，前房可见，植片未见明显水肿(图2A)；实验对照组角膜植片轻微水肿，前房可见(图2B)；空白对照组角膜植片透明度好，前房可见，植片未见明显水肿(图2C)。

术后14 d，实验组植片仍维持一定厚度和透明性，植片稍水肿，前房可见(图2D)；实验对照组植片开始水肿混浊(图2E)；空白对照组角膜植片透明度较好，前房可见，植片未见明显水肿(图2F)。

术后30 d，实验组植片较前稍水肿，但仍维持一定透明性，前房可见(图2G)；实验对照组植片明显水肿混浊，前房深度隐约可见(图2H)；空白对照组角膜植片透明度较好，前房可见，植片未见明显水肿(图2I)。

术后60 d，实验组植片水肿较重，但仍维持一定透明性，前房可见(图2J)。

实验对照组植片发生严重大泡性改变，前房深度浅(图2K)；空白对照组角膜植片透明度较好，前房可见，植片未见明显水肿(图2L)。

Figure 2 Photos of Rhesus monkey corneal graft each group at different time points after surgery.A：3 days after surgery in the experimental group；B：3 days after surgery in the experimental control group；C：3 days after surgery in the control group；D：14 days after surgery in the experimental group；E：14 days after surgery in the experimental control group；F：14 days after surgery in the control group；G：30 days after surgery in the experimental group；H：30 days after surgery in the experimental control group；I：30 days after surgery in the control group；J：60 days after surgery in the experimental group；K：60 days after surgery in the experimental control group；L：60 days after surgery in the control group 术后不同时间点各组恒河猴角膜植片大体图片。A：实验组术后3 d；B：实验对照组术后3 d；C：空白对照组术后3 d；D：实验组术后14 d；E：实验对照组术后14 d；F：空白对照组术后14 d；G：实验组术后30 d；H：实验对照组术后30 d；I：空白对照组术后30 d；J：实验组术后60 d；K：实验对照组术后60 d；L：空白对照组术后60 d

2.4 角膜植片CD34免疫组化切片及HE染色切片 抗CD34单克隆抗体免疫组化染色显示实验组有一层HUVEC在角膜内表面生长，胞浆被染成棕黄色，与角膜基质层融合，细胞基底处未见明显后弹力层样物质(图3A)。实验对照组缺乏后弹力层和CEC层，裸露角膜基质角膜水肿(图3B)。空白对照组抗CD34单克隆抗体免疫组化染色显示一层CEC被覆于角膜后弹力层上，CEC胞浆未着染棕黄色，为正常角膜切片(图3C)。

实验组角膜组织切片HE染色显示一层HUVEC在角膜内表面生长，与角膜基质贴附良好，细胞基底面未见明显后弹力层样物质(图3D)。实验对照组未见任何细胞生长，裸露角膜基质，角膜水肿(图3E)。空白对照组角膜组织切片HE染色显示完整的CEC层，细胞基底为有明显的深染的后弹力层(图3F)。

2.5 恒河猴角膜植片以及小梁网区域术前术后扫描电镜图像 空白对照组保存完整的六边形CEC层，细胞之间连接紧密(图4A)。实验对照组角膜内表面残留胶原纤维样物质(图4B)。实验组HUVEC种植后30 d，HUVEC疏松贴附于去除CEC层的恒河猴角膜内表面，细胞胞体变大，开始向周围伸展，细胞表面多个细绒毛状白色突起，部分细胞间已相互接触形成紧密连接(长箭头)，但仍然可见无细胞被覆的角膜基质胶原纤维裸露区域(短箭头)，HUVEC周围可见多个白细胞及少量红细胞(燕尾箭头)(图4C)。HUVEC种植后60 d：种植上去的HUVEC形态已开始向成熟细胞分化，细胞之间连接呈片状覆盖于去除CEC层的恒河猴角膜内表面。但HUVEC周围可见大量白细胞(图4D)。一些种植上去的VEC嵌顿于小梁网处，并可见多量白细胞及细胞碎片堵塞小梁网空隙(图4E-图4F)。

Figure 4 Scanning electron microscope images of Rhesus monkey corneal graft and trabecular meshwork before and after surgery；A：Normal Rhesus monkey cornea(×600)；B：Corneal stromal collagen fibers exposed after removing the corneal endothelial cell layer(×3000)；C：30 days after HUVEC implant in the experimental group(×900)；D：60 days after HUVEC implant in the experimental group(×900)；E：Ttrabecular meshwork image after HUVEC implant in the experimental group(×150)；F：Ttrabecular meshwork image after HUVEC implant in the experimental group(×1000) 恒河猴角膜植片以及小梁网区域术前术后扫描电镜图像。A：空白对照组恒河猴CEC图像(×600)；B：实验对照组去除CEC层之后裸露角膜胶原基质纤维(×3000)；C：实验组HUVEC种植到角膜内表面后30 d，部分细胞间已相互接触形成紧密连接(长箭头)，但仍然可见无细胞被覆的角膜基质胶原纤维裸露区域(短箭头)，HUVEC周围可见多个白细胞及少量红细胞(燕尾箭头)(×900)；D：实验组HUVEC种植到角膜内表面后60 d(×900)；E：实验组HUVEC种植到角膜内表面后的小梁网(×150)；F：实验组HUVEC种植到角膜内表面后的小梁网(×1000)

3 讨论

国内外目前对于角膜内皮功能失代偿治疗的研究主要集中于以下方面：(1)利用异体角膜基质[1]、羊膜[2-3]和其他材料[1，4-5]为体外培养的CEC的载体进行内皮细胞移植；(2)各种类型的后弹力层CEC移植术[6-9]；(3)体外培养 “永生化CEC”的研究。以上研究均获得了一些新的发现，但仍然难以在临床推广。为此我们力求寻找一种能再生且具有CEC样功能的细胞来替代受损的CEC。VEC与CEC具有结构和功能上的诸多相似性[10]：两种细胞均为单层细胞分布；两种细胞膜上都具有共同维持细胞内、外水平衡功能的钠离子通道和水通道蛋白1、4型；房水属于血液的超滤液，其化学成分与血浆基本相似。两种细胞的不同之处：灵长类动物(包括人类)CEC在成年后不再进行有丝分裂；VEC再生性强，受损后可增殖修复而形成完整的内皮屏障；VEC能自分泌产生血管内皮生长因子等细胞因子。Gospodarowicz等[11]首次提出了用VEC替代CEC的想法，通过动物实验取得了一定的成果，但自体VEC的取材和培养都较为困难。

实验中我们选择的HUVEC来源广泛，免疫原性低，并且通过病理切片和扫描电镜观察HUVEC能被移植到去除后弹力层的恒河猴角膜内表面，存活一定时期，维持了一定程度角膜的透明性和厚度，这将使HUVEC有可能成为用于替代人CEC功能的可供选择的细胞之一。

本实验中，实验对照组术后60 d角膜植片呈现典型角膜大泡性改变，病理切片和扫描电镜也证实该组恒河猴CEC受损后，周边健存的CEC无法分裂增殖，与人类相似[12]。随着时间的推移，实验对照组角膜植片水肿和混浊情况随时间加重最终形成典型的大泡性改变；而实验组术后角膜植片虽然也有发生水肿混浊的趋势，但速度明显慢于实验对照组，证明移植上去的HUVEC在一定时间内起到了阻隔房水进入角膜实质的屏障作用，但由于移植上去的HUVEC从贴壁到胞体逐渐变大向周围伸展，最终彼此紧密连接成单层细胞还需要一段时间，所以术后角膜植片仍然有发生水肿混浊的可能。

本实验中我们发现，HUVEC种植到了去除内皮层的角膜植片上后与角膜基质融合，其下缺乏均匀显色的后弹力层样物质。这可能是因为：正常情况下，角膜后弹力层损伤后由CEC分泌的蛋白重新组成新的后弹力膜维持角膜的完整性[13]。然而，血管内膜损伤后只能靠血管基底膜中的平滑肌细胞迁移及其分泌的纤维蛋白来完成内膜的修复功能，平滑肌细胞的迁移和VEC的再生需要健康VEC分泌的一些细胞因子参与[14]，这说明血管内膜的形成是血管平滑肌细胞和VEC相互作用的结果。实验中扫描电镜未见HUVEC多层生长或形成管状结构。可能的原因有：(1)细胞生长的接触抑制作用[15-18]。正常的体内条件下，内皮细胞可能更接近于这种状态。文献报道[19-20]，小鼠成纤维细胞系NIH3T3的CD155分子表达下调与其细胞接触抑制有关。(2)植片表面平坦面积较大。(3)离心沉淀法的应用。离心沉淀法移植HUVEC最初少量细胞会堆积于植片内表面，但堆积的HUVEC会因无法贴壁生长以及房水的流动而脱落。(4)房水营养成分。房水中蛋白质、氨基酸和葡萄糖的含量低于血浆，使位于房水环境中的HUVEC不会出现过度增殖的情况。

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date：Jun 2，2014

Accepted date：Jul 16，2014Foundation item：Yunnan Provincial Science and Technology Department - Kunming Medical College Joint Project(No：2013FB109)From theDepartmentofOphthalmology，theFourthAffiliatedHospitalofKunmingMedicalCollege(ZHANG Wen-Jia，HU Zhu-Lin，ZHU Qin，WEI Chun-Ling，LIU Hai，YANG Zhong-Kun)，Kunming650021，YunnanProvince，China；ChinesePekingUnionMedicalBiologicalInstution，ChineseAcademyofMedicalSciences(SUN Xiao-Mei，DAI Jie-Jie)，Kunming650000，YunnanProvince，China

Responsible author：HU Zhu-Lin，E-mail：1021862477@qq.com

Microstructure observation of human vascular endothelial cells transplantation in autograft to replace monkey corneal endothelial cells

ZHANG Wen-Jia，HU Zhu-Lin，ZHU Qin，WEI Chun-Ling，SUN Xiao-Mei，DAI Jie-Jie，LIU Hai，YANG Zhong-Kun

vascular endothelium cell；corneal endothelium cell；rhesus monkey

Objective Using the Descemet’s membrane-removed rhesus autologous corneal as the cell carrier and transplant the cultured human umbilical vein endothelial cells(HUVEC) to the inner surface of the cornea，to observe the function of HUVEC after alternative rhesus monkey corneal endothelial cell and the growth of the HUVEC in the rhesus monkey eye corneal surface.Methods The experimented monkeys were divided into 3 groups：experimental group(3 cases)，experimental control group(2 cases) and blank control group(1 case).In experimental group，cultured HUVEC were transplanted onto rhesus monkey posterior corneal surface without corneal endothelium；In experimental control group，the detached corneal Descemet membrane of rhesus monkey fixed in suit without cultured HUVEC transplantation；In blank control group，a simple penetrativity corneal transplantation without destroy the descemet membrane performed.The transparent of implants in each group was observed after corneal transplantation.Histopathology of cornea grafts，immunohistochemistry and scanning electron microscope were performed at 30 days and 60 days postoperatively in order to observe the appearance of HUVEC onto the monkey posterior corneal surface and the structure of anterior chamber angle.Results The corneal implants of experimental group kept transparency and thickness in some extent while the experimental control group showed severity corneal edema and bullae.Histopathology of corneal grafts showed that a cells layer with CD34 staining positive reaction growth on posterior corneal surface of corneal button in the experimental group，which indicated that the layer of cells were HUVEC，no cell and material like membrane could be seen on that of the experimental control group；A layer of corneal endothelial cells and Descemet’s membrane were visible on that of the blank control group.Scanning electron microscope showed that a layer of HUVEC were growing on the posterior surface of cornea button with plenty of leucocytes and small amounts of cell debris could be found to block up the trabecula meshwork，collagen fibers remained on the posterior surface of cornea button of the experimental control group with no cell grown；The complete corneal endothelial cells layer with six-fringe shape could be found in the blank control group.Conclusion HUVEC can survive and enduce the barrier function at the posterior surface of rhesus monkey cornea without corneal endothelial cells，and keep the cornea button transparency and normal thickness in some extent，but severe rejection will happen.

张文佳，胡竹林，朱勤，韦春玲，孙晓梅，代解杰，等.人脐静脉血管内皮细胞在体移植替代猴角膜内皮细胞的形态学分析[J].眼科新进展，2014，34(11)：1020-1024.

10.13389/j.cnki.rao.2014.0283

张文佳，女，1982年1月出生，云南省昆明市人，硕士，研究方向为角膜病、白内障。联系电话：13577090718；E-mail：1021862477@qq.com

About ZHANG Wen-Jia：Female，born in January 1982.Master degree.Tel：13577090718；E-mail：10218624 77@qq.com

2014-06-02

2013年云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项(编号：2013FB109)

650021 云南省昆明市，昆明医科大学第四附属医院眼科(张文佳，胡竹林，朱勤，韦春玲，刘海，杨忠昆)；650000 云南省昆明市，中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所(孙晓梅，代解杰)

胡竹林，E-mail：102186 2477@qq.com

修回日期：2014-07-16

本文编辑：董建军

[Rec Adv Ophthalmol，2014，34(11)：1020-1024]