周娅静，常 靖，石海燕，王 青，马雪梅

(中北大学化工与环境学院，山西 太原 030051)

甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch 具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功效[l-2]，主要化学成分包括三萜皂苷类、黄酮类及多糖类化合物三大类。黄酮类是甘草中最重要的活性物质[3-5]，具有明显抗肿瘤、抗溃疡、抗炎、抗艾滋病等作用[6-7]。甘草素(liquiritigenin)是存在于甘草中的二氢黄酮单体化合物，具有抗癌、抗溃疡、抗炎、保肝等生理功效[8]。异甘草素(isoliquiritigenin)是存在于甘草中的查尔酮单体化合物，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗病毒等作用，还对哮喘病、糖尿病及艾滋病等疾病也有较强的药理作用[9-10]。笔者采用高效液相色谱-紫外分光光度(HPLC-UV)波长转换法对甘草中甘草素和异甘草素进行含量测定，此方法可用于甘草药材的质量评价，同时可为其他药材中有效成分的测定和提取提供参考。

1 仪器与试药

大连依利特230 系列高效液相色谱仪(UV 230+紫外-可见检测器、P230 高压恒流泵、LU 230 低压梯度混合器、7725i 手动进样阀)。异甘草素对照品(批号为20100603)、甘草素对照品(批号为MUST-12022207)均来自西安开来生物工程有限公司，纯度98%;甘草药材2012 年10 月购自山西中医学院，经鉴定为甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch;甲醇(天津市申泰化学试剂有限公司，分析纯)，超纯水(自制)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Hyporsil ODS2 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇-水(45 ∶55)，等度洗脱;检测波长:0 ～25 min 时为276 nm，25 ～70 min 时为360 nm;流速:0.8 mL/min;柱温:室温。对照品和供试品分离色谱图见图1。

2.2 溶液制备

称取甘草素对照品1.6 mg 及异甘草素对照品0.7 mg，精密称定，置25 mL 容量瓶中，加甲醇制成每1 mL 分别含0.028 mg异甘草素和0.064 mg 甘草素的混合溶液，即得对照品溶液。取甘草药材粉碎(过60 目筛)约0.5g，精密称定，精密加入80%甲醇25 mL，称定质量，超声处理40 min，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.22 μm 滤膜过滤，即得供试品溶液。

图1 高效液相色谱图

2.3 方法学考察

线性关系考察:精密吸取2，4，6，8，10 μL 甘草素和异甘草素的混合对照品溶液，以峰面积(X)为横坐标、各对照品进样量(Y)为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程。异甘草素的回归方程为 Y=0.004 5 X-1.144 7，R2=0.999 6，进样量线性范围为0.028 ～0.28 μg。甘草素的回归方程为Y=0.004 8 X-0.773 7，R2=0.999 1，进样量线性范围为0.064 ～0.64 μg。

精密度试验:取同一对照品溶液，连续进样5 次。结果异甘草素的峰面积一致，RSD 为1.8%;甘草素的峰面积一致，RSD 为2.7%，均小于3%。

重复性试验:取同一批甘草药材5 份各0.5 g，依法制成供试品溶液，进样测定。结果异甘草素的RSD 为1.63%，甘草素的RSD 为2.16%，表明方法重复性良好。

稳定性试验:分别取2.2 项下方法制得的同一供试品溶液，于0，2，4，6，8，10 h 时重复进样6 次，测定含量。结果3 个样品中甘草素和异甘草素含量的RSD 分别为1.54%，1.81%，1.62%和1.72%，1.83%，2.01%，表明供试品溶液在10 h 内稳定。

加样回收试验:分别取异甘草素和甘草素对照品适量，加入到已知含量的甘草药材粉末中，按照2.2 项下方法制备供试品溶液依法测定含量，计算回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

取2.2 项下方法制备的供试品溶液3 份，按拟订色谱条件进样，每种供试品溶液重复进样3 次，计算其平均值，然后根据标准曲线来计算含量。结果3 种样品中甘草素含量依次为0.31，0.34，0.32，异甘草素含量依次为0.24%，0.25%，0.27%。

3 讨论

在对甘草中的异甘草素和甘草素进行提取时，分别研究了不同的提取方法。控制提取时间为40 min，以甲醇作为提取溶剂，进行热回流提取;以甲醇作为提取溶剂，室温浸泡、浓缩得提取物;在超声辅助下，用不同极性的甲醇(45%，70%，80%，100%)作为提取溶剂，得提取物。这些提取物都进行了2 种成分的含量测定。结果显示，超声辅助下80%甲醇的提取效果最好。

表1 异甘草素和甘草素加样回收试验结果( n=9)

试验比较了以甲醇-水、甲醇-醋酸-水、乙腈-水作为流动相进行等度洗脱。这些不同的流动相系统对2 种成分的分离效果相差不大。同时发现，当以甲醇-醋酸-水系统作流动相时，甘草素的峰形对称性明显变好，分离度有所增大，但此系统不利于异甘草素的分离，使异甘素的峰高明显降低，不利于分析。综合考虑到普遍适用性，试验选择毒性较小的甲醇-水作为流动相。试验还比较了不同比例甲醇-水作流动相时对甘草素和异甘草素的分离效果，结果表明，甲醇-水(45 ∶55)具有分离效果好、灵敏度高、检测时间短等优势。

试验采用了0.6，0.8，1.0 mL/min 3 个不同的流速，以比较系统不同流速对异甘草素和甘草素的分离效果。结果表明，流动相流速为0.6 mL/min 时，异甘草素的重现性较差;流速为1 mL/min时，甘草素与提取物中其他的杂质不能很好分离，分离度达不到分析要求。综合考虑，选择0.8 mL/min 为最佳流速。

对异甘草素和甘草素对照品溶液在200 ～800 nm 波长范围内扫描。甘草素在213 nm 波长处有最大吸收，考虑到甲醇的截止波长，本试验选择了276 nm 波长作为甘草素的检测波长，以避免流动相对分析结果的影响;异甘草素则选择了其最大吸收波长360 nm 作为检测波长，同时在该波长上可以避免一些杂质峰的干扰。甘草素和异甘草素都是甘草中的活性成分，建立波长切换HPLC 法同时测定了不同甘草提取物中两者含量，方法简便、快捷、重现性好，在对甘草活性成分的测定上有一定的创新性，可为科学全面评价地甘草提供试验依据。

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