李启照，尹 伟，戴一

（安徽新华学院 药学院，安徽 合肥 230088）

三七保健酒中三七皂苷含量测定与加速稳定性研究

李启照，尹 伟，戴一

（安徽新华学院 药学院，安徽 合肥 230088）

目的：通过对三七保健酒中功效成分的测定和稳定性研究,建立具有明确功能的重要成分的质量指标,有效保证保健酒的产品品质.方法：选择保健酒中皂苷建立符合相关要求规定的检测方法,采用高效液相色谱法检测，同时进行加速稳定性试验.结论:该方法稳定、快速准确、精密度高、重现性好,可用于三七保健酒的质量控制.为三七保健酒的开发利用提供参考.

三七保健酒；三七皂苷；高效液相色谱法；稳定性

三七保健酒是根据经典秘方选用三七、枸杞、桂圆、米酒等多味中药，采取现代中药超微粉碎技术及浓缩提取工艺研制生产而成的纯中药制剂.具有止血生肌，消肿止痛，舒筋活血，活血祛瘀.君药三七主要有效成分三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1，为保证三七保健酒质量，本文采用HPLC测定了三七药材中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量.同时进行加速稳定性试验.

1 仪器与试剂

高效色谱仪Aglient1260，G1315D检测器；三七皂苷对照品：三七R1(批号120704-200923)，人参Rg1(批号1207-200917)，人参Rb1(批号120745-200815)均购自中国药品生物制品检定所；三七药材，由安徽新华学院药学院生药教研室鉴定；乙腈、甲醇均为色谱纯.

2 方法与结果

2.1 测定方法选择

本品处方由三七、枸杞、桂圆、红花等十几味中药组成，三七为君药选择作为该制剂含量测定药材.三七中主要含三七素、三七皂苷等成分，研究表明[1]，三七中的有效活性部位为三七皂苷，三七皂苷的含量测定方法文献报道有比色法、薄层扫描法、HPLC法等，其中HPLC法报道较多，该法被药典收载较为灵敏准确，因此本实验采用HPLC法测定三七保健酒中三七皂苷R1+人参皂苷Rb1+Rg1的含量，作为考察其制剂的质量控制指标[2].据药典的方法及参照文献人参皂苷Rg1和Rb1及三七皂苷R1提取条件，乙醚脱脂处理后，使用甲醇索氏提取，萃取总皂苷用水饱和正丁醇反复萃取，用水洗除杂，除去干扰的其它成分，从而使定量分析的结果更加准确[3].

2.2 色谱条件及系统适应性试验

色谱柱：Vp-ODS150×4.6mm；流动相：乙腈为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱；流速为1mL/min，检测波长203nm，柱温30℃.理论板数按三七皂苷R1峰计算应不低于4000.参照药典三七项下高效液相色谱法中的液相条件，优化出本试验的流动相梯度，乙腈∶水(15∶85 12 min 30∶70 45min15∶85v/v).

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备

精密称定人参皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1对照品适量加甲醇，分别制成每1mL含人参皂苷Rb10.4mg、Rg10.4mg和三七皂苷R10.1mg的混合溶液，作为对照品溶液.

2.3.2 供试品溶液的制备

精密吸取三七保健酒10mL，置索氏提取器中，加适量乙醚，加热回流1小时，弃去乙醚液，药渣挥去乙醚；置索氏提取器中，加适量甲醇，加热提取至甲醇无色，挥干甲醇提取液，残渣加水20mL溶解，用水饱和的正丁醇提取3次（20mL，20mL，15mL），合并提取液，再用30mL正丁醇饱和的水洗涤，水洗液弃，蒸干正丁醇液，残渣加甲醇溶解，定量转移至25mL量瓶内，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液[4].

2.4 标准曲线与线性范围

精密称取适量对照品人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1，加甲醇分别制成每1mL含人参皂苷Rg10.4mg、人参皂苷Rb10.4mg和三七皂苷R10.1mg的混合溶液，即得.吸取4μl、8μl、12μl、16μl、20μl进样测定，以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及 Rb1对照品溶液进样量（μl）为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，进行线性回归,回归方程和相关系数为:Y=84396X+75747,r=0.9990(n=5)；Y=57175X -187.2,r=0.9992(n=5)；Y=12266X-1475.8,r=0.9996 (n=5).结果表明:人参皂苷Rg1在1.65～8.32μg、人参皂苷Rb1在1.58～7.85μg、三七皂苷R1在0.425～2.16μg范围内进样量与峰面积线性关系良好[5]. 2.5稳定性试验

依药典含量测定项下方法，精密吸取供试品溶液于0、2、4、6、8小时分别进样一针，记录色谱图，对本品溶液稳定性情况进行分析，实验结果测得人参皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1的RSD分别为1.42%，1.26%和1.22%.表明本品溶液的稳定性较好，结果见表1.

表1 稳定性性试验考察表

2.6 精密度试验

按照药典含量测定项下方法，分别精密吸取供试品溶液10μl，连续进样6针，记录色谱图，对本法的精密度情况考察分析，结果测得人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1的RSD分别为1.29%，1.36%，1.49%.表明本法精密度较好.结果见表2.

表2 精密度试验考察表

2.7 重现性试验

按含量测定项下方法制备供试品溶液，取同一批号的本品试样，精密称取5份制备供试品溶液.各吸取10μl分别注入液相色谱仪，测定其峰面积，统计学处理，人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1的RSD分别为1.47%，1.42%，1.39%，实验结果表明本法重现性较好，结果见表3.

表3 重现性试验考察表

2.8 加样回收率试验

制取供试品溶液:精密量取试样10mL与索氏提取器中，同时精密称取人参皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1适量,分别加入上述索氏提取器中，按照上述方法制取供试品溶液.精密吸取10μL供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，分别计算其回收率.人参皂苷Rb1、Rg1、和三七皂苷R1的平均回收率分别为98.29%，98.22%，98.31%.RSD%分别为1.13%，1.22%，1.34%.实验结果符合相关要求.结果见表4，表5，表6.

样品中含量(mg) 加入对照品量(mg) 实测含量(mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 1.66 1.80 3.426 97.87 1.71 1.80 3.435 96.95 1.77 1.80 3.592 98.91 98.29 1.13 1.81 1.80 3.654 99.45 1.67 1.80 3.464 98.31

表6 三七皂苷R1加样回收试验结果

表5 人参皂苷Rg1加样回收试验结果

2.9 样品的含量测定

根据药典规定：三七药材中三七皂苷R1+人参皂苷Rb1+Rg1的含量应不得低于5.0%；据此折算三七保健酒中三七皂甙R1+人参皂苷Rb1+Rg1的理论含量应不得低于8mg/mL，经对三批三七保健酒进行含量测定，三七皂甙R1+人参皂苷Rb1+Rg1的总含量为8.27-11.35mg/mL.根据保健食品有关标准规定考虑实际生产的特点，将其下限定为合量限度，即本品每mL含三七皂甙R1+人参皂苷Rb1+ Rg1应不低于8.0mg/mL. 2.10加速稳定性试验

图5 对照品的HPLC图谱

图6 药材的HPLC图谱

图7 人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1混合对照品HPLC图谱

图8 三七药材HPLC图谱

将三批样品在温度20℃±5℃，相对湿度70% ±5%的条件下放置3个月，在0个月、1个月、2个月、3个月定期进行各项测定.按照GB2757—81《蒸馏酒及配制酒卫生标准》、GB2758—81《发酵酒卫生标准》、QB/T1981—94《露酒》标准等相关标准要求研究三七保健酒的稳定性.实验结果显示：三批样品在感官指标棕红色药香、酒香协调，口感醇厚、色泽透明、有光泽、无异味、无沉淀物；生物稳定性在120、126、128、132德勒度；药汁量（w/w）在12%、12.6%、12.9%、13.4%；总糖（以葡萄糖计）g/L为97、113、118、121；总酸（以乙酸计）g/L在5.6、6.1、6.4、6.7；卫生学指标均符合GB/T5009.48规定控制菌数未检出.通过三批试样的加速稳定实验，三七保健酒各项指标没有明显的变化，质量稳定.

3 讨论

药典中未见三七保健酒的含量测定项，无法实现对三七保健酒的有效质量控制；参照《中国药典》2010年版一部中三七含量测定方法，并结合本制剂特点采用高效液相色谱法，测定三七药材中人参皂苷Rb1+Rg1+三七皂甙R1的含量.作为控制三七保健酒的质量的方法.方法稳定，精密度高，重现性好，快速准确，能较好地对生产过程中的原药材及成品进行质量监控，提高了制剂标准的可行性及可靠性.可作为该制剂质量控制方法.稳定性检查研究，按照相关标准对三批样品的感官指标、生物稳定度、药汁量、总糖、总酸及卫生学指标进行检查，结果样品各项指标均符合要求.三七保健酒稳定性较好.

〔1〕国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部). [M]北京:化学工业出版社，2010.7，10.

〔2〕陈玉勇,秦枫,朱海燕.三七总皂苷的乙醇超声法提取工艺及急性毒性研究 [J].安徽农业科学, 2008(7)：40-41.

〔3〕葛竹兴,秦枫.高效液相色谱—质谱联用法检测三七总皂苷中Rg_1和Re的含量[J].中国医药导刊,2008(9)：121-123.

〔4〕孔繁晟,贲永光,曾昭智.三七总皂苷超声提取工艺研究[J].广东药学院学报,2011(4)：36-37.

〔5〕侯茂奇,王长虹,杨莉.正交实验优选三七总皂苷的提取工艺研究[J].上海中医药大学学报,2009 (4)：47-48.

〔6〕周家明，高明菊，赵爱.从鲜三七根茎中提取三七总皂苷的工艺研究[J].中国产业,2011(5)：111-113.

R284

A

1673-260X（2014）04-0128-04

安徽教育厅自然科学研究项目（KJ2012B071）；校级质量工程（2011Rcpyx01;2012xwsjx07)