朱政斌, 喻鑫玲

(1.湖南理工学院 化学化工学院, 湖南 岳阳 414006; 2. 湖南省血吸虫病防治所, 湖南 岳阳 414000)

日本血吸虫童虫在东方田鼠和昆明小鼠中的蛋白差异初探

朱政斌1, 喻鑫玲2

(1.湖南理工学院 化学化工学院, 湖南 岳阳 414006; 2. 湖南省血吸虫病防治所, 湖南 岳阳 414000)

东方田鼠具有天然抗日本血吸虫活性, 为了筛选抗日本血吸虫疫苗分子, 通过日本血吸虫尾蚴感染东方田鼠和昆明小鼠, 感染11天后收集东方田鼠和昆明小鼠肝童虫. 肝童虫经组织匀浆收集蛋白质并进行蛋白质定量后SDS-PAGE分离, 切取差异蛋白条带进行蛋白质鉴定. 发现差异蛋白主要为日本血吸虫结构蛋白, 能量代谢相关蛋白以及热休克蛋白等. 为进一步研究抗日本血吸虫疫苗奠定了基础.

东方田鼠; 日本血吸虫童虫; 结构蛋白; 能量代谢相关蛋白; 热休克蛋白

血吸虫病是六大重点热带病之一, 主要流行于非洲、中东、南美、东亚和东南亚的76个国家和地区.全球大约有6亿多人受到威胁, 2亿多人受感染, 2000多万人有严重临床症状[1]. 日本血吸虫病在我国长江中下游地区广泛存在, 是我国主要的寄生虫病[2]. 东方田鼠是唯一对日本血吸虫有抗性的啮齿类哺乳动物,是研究日本血吸虫抗病机制的最佳动物模型[3]. 研究发现, 日本血吸虫尾蚴感染东方田鼠由皮肤进入体内移行, 经过肺脏至肝脏, 在肝脏中停止发育并最终在肝脏消亡[4]. 筛选东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关的靶分子, 对研制抗日本血吸虫疫苗和治疗药物具有重要借鉴意义[5]. 本文通过蛋白质组学方法, 筛选日本血吸虫童虫在东方田鼠和昆明小鼠肝脏中的差异蛋白, 进一步深入了解东方田鼠感染日本血吸虫后的抗日本血吸虫机制, 为进一步研究开发抗日本血吸虫抗原提供依据.

1 材料与方法

1.1 实验动物

东方田鼠(80～100克)由湖南省血吸虫防治研究所提供, SPF级昆明小鼠(25～28克)购自湖南景达斯莱克实验动物中心. 每种动物在实验中均随机分组, 雌雄各半. 每组动物均感染30只.

1.2 童虫收集和动物感染

感染日本血吸虫阳性钉螺由湖南省血吸虫病防治所筛选. 在室温条件下, 用双蒸水将阳性钉螺洗涤干净, 将其置于三角瓶中, 然后在光照条件下逸尾蚴, 使用腹部贴片法感染, 每只东方田鼠感染1000条尾蚴, 每只昆明小鼠感染50条尾蚴, 感染时间20min. 感染11天后, 从动物肝脏收集童虫, 童虫收集方法为将动物肝脏组织剪成小块后在生理盐水中让童虫释放, 在解剖镜下收集童虫.

1.3 童虫蛋白提取与分离

将从东方田鼠和昆明小鼠肝脏中收集的童虫分别进行组织匀浆, 组织匀浆在缓冲液中(缓冲液为5 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 0.05% Nonidet P-40, 0.5 mM Na3EGTA, 0.5 mM Na3EDTA, and protease inhibitors cocktail; Roche公司产品)进行, 操作温度为4℃, 匀浆后进行离心, 离心条件为离心力10000g, 温度为4℃,离心时间20min, 离心完成后收集上清. 上清液蛋白质浓度用BCA试剂盒进行蛋白质定量. 蛋白质定量后进行SDS-PAGE分离, SDS-PAGE采用4-15%线性梯度分离胶进行分离.

1.4 差异蛋白质提取

差异蛋白质提取方法如文献[6]所示, 基本过程如下: (1)脱色: 考马斯亮蓝染色的蛋白质条带切下后置于微量离心管中, 用去离子水冲洗两次后加入 25mmol/L 碳酸氢铵/50%乙腈脱色直至考马斯亮蓝完全被清除, 吸干溶液后切碎胶块, 并用 200mmol／L的碳酸氢铵溶液清洗, 用 100%乙腈脱水至胶块变为白色, 真空干燥. (2)还原和烷基化: 在上述处理的样品中加入50μL100 mmol/L碳酸氢铵(含DTT 10mmol/L), 57℃保温l h后室温冷却, 除掉过量溶液, 迅速加入等体积的用100 mmol/L 碳酸氢铵新鲜配制的55mmol／L碘乙酰胺, 暗室常温反应30min, 反应完成后用100mmol/L的碳酸氢铵洗涤, 再用100%乙腈脱水后冻干．(3)酶解: TPCK胰蛋白酶用50mmol/L的碳酸氢铵(含5mmol/L CaCl2)配成0.1g/L的溶液, 每管加入10μL酶解液, 待胶块吸收后将多余酶液吸去, 之后加入20 μL不含酶的缓冲液覆盖, 于37℃过夜消化. (4)萃取: 将酶解后的肽用50μL5%TFA/50%ACN 进行萃取两次, 合并萃取液, 冻干后进行质谱分析.

1.5 Q-TOF MS质谱分析与数据库检索

酶解产物鉴定方法根据文献[6]进行, 质谱仪为英国Micromasss公司生产的电喷雾—四极杆一飞行时间串联质谱Micro Q-TOF, 连接毛细管色谱柱液相色谱仪和钠升喷雾源. 待测样品进行全自动分析, 经Cl8毛细管柱梯度洗脱后进行肽段分离, 本次实验操作的梯度为一小时中乙晴浓度从5%至50%, 流速3μL/min,将分离后的肽段直接进入ESI离子源, 其中强度超过阈值的肽段自动进行MS／MS测定. 所有MS的数据测定均在正离子模式下进行. 质谱仪的校正是采用PPG-2000的串联碎片校正的, 质量误差为士0.1Da. 质谱数据以pk1.的文件格式提交Mascot搜索, 数据库选NCBInr.

2 实验结果与讨论

2.1 童虫提取蛋白SDS-PAGE分离

童虫提取蛋白进行SDS-PAGE分离后进行考马斯亮蓝染色, 结果如图1. 采用软件进行分析, 发现从东方田鼠和昆明小鼠中分离获得的童虫有10个差异条带. 这些差异条带在低分子量到高分子量区间均有分布.

图1 日本血吸虫童虫提取蛋白SDS-PAGE分离图谱

2.2 质谱数据检索结果

质谱数据数据库扫描结果如图 2所示,可以确定多肽序列和蛋白质序列以及蛋白质名称等信息. 质谱数据的数据库检索结果见表 1. 由表 1的数据可以看出, 日本血吸虫在东方田鼠和昆明小鼠肝脏中差异蛋白质主要体现在结构蛋白质部分: 如Actin蛋白和Keratin蛋白; 能量代谢蛋白部分: 如苹果酸脱氢酶、ATP合酶beta亚基等; 热休克蛋白部分: 如 HSP60、HSP70、HSP75以及HSP83等蛋白质. 日本血吸虫童虫结构蛋白在东方田鼠肝脏内表达水平下调, 据此可以说明东方田鼠可能通过抑制日本血吸虫童虫结构蛋白表达,从而实现抑制日本血吸虫发育. 日本血吸虫童虫能量代谢蛋白下调, 说明日本血吸虫童虫在东方田鼠体内代谢水平低下, 能量代谢受阻, 从而影响日本血吸虫在东方田鼠体内发育. 同时日本血吸虫在东方田鼠体内热休克蛋白高水平表达, 说明东方田鼠体内环境不利于日本血吸虫童虫发育. 从不同类型蛋白质表达水平的差异说明东方田鼠通过多途径、多手段实现对日本血吸虫的杀灭作用.从目前日本血吸虫疫苗的研究现状以及非适宜宿主东方田鼠对日本血吸虫杀灭作用研究发现, 单一蛋白疫苗在日本血吸虫减虫率和减卵率方面作用有限, 需要通过开发多价疫苗才可能达到抑制日本血吸虫发育以至杀灭.

图2 Actin蛋白质多肽片段质谱解析结果

表1 日本血吸虫童虫在东方田鼠和昆明小鼠肝脏差异蛋白质

[1] Chitsulo L, Engel D, Montrosor A, et al. The global status of schistoeomissis and its control[J]. Acta Trop, 2000, 27(1): 41～51

[2] 周晓农, 汪天平, 林丹丹, 等. 我国血吸虫病防治研究现状与发展战略思考[J]. 中国血吸虫病防治杂志, 2004, 17(1): 1～3

[3] 姚利晓, 林娇娇, 蔡幼民, 等. 东方田鼠抗日本血吸虫的研究进展[J]. 中国血吸虫病防治杂志, 2003, 15(6): 471～473

[4] 贺宏斌, 左家铮, 周利红. 东方田鼠实验感染日本血吸虫的研究[J]. 湖南医学, 1992, 9(2): 65～67

[5] 袁忠英, 沈玉娟, 曹建平, 等. 东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫童虫cDNA文库及新基因分析[J]. 中国血吸虫病防治杂志, 2008, 20(4): 255～259

[6] 聂东宋, 刘 宇, 吴 喆, 等. 莽山烙铁头蛇粗毒双向凝胶电泳分析[J]. 湖南理工学院学报, 2011, 24(1): 48～51

The Differential Proteins of the Hepatic Schistosomula in the Liver of the Microtus Fortis and Mouse

ZHU Zheng-bin1, YU Xin-ling2
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Institute of Science and Technology, Yueyang 414006, China; 2. Hunan Institute of Parasite Disease, Yueyang 414000, China)

Microtus fortis is naturally resistant to Schistosoma japonicum．In order to find against Schistosoma japonicum antigen, the Microtus fortis and Kunming mouse are used in this study. They are challenged with cercariae of Schistosoma japonicum. The livers of the microtus fortis and mouse are collected at 11 days after infection. The proteins from the hepatic Schistosomula separated with SDS-PAGE. The differential proteins are analyzed by in-gel digestion and MS/MS identification. The result shows that the structure protein and energy metabolism protein are significantly down-regulated in the liver of Microtus fortis at 11 days after infection. The heat shock proteins are significantly up-regulated in the liver of Microtus fortis at 11 days after infection.

Microtus fortis; hepatic schistosomula; structure protein; energy metabolism protein; heat shock protein

Q516

A

1672-5298(2014)04-0071-03

2014-10-21

湖南省科技厅科研条件创新专项(2010[D203])

朱政斌(1962− ), 男, 湖南岳阳人, 湖南理工学院化学化工学院实验师. 主要研究方向: 生物化工, 有机合成