桑叶中黄酮及1—脱氧野尻霉素的含量影响因素与检测方法

2014-07-18顾寅钰等

山东农业科学 2014年4期

关键词：芦丁黄酮类检测器

顾寅钰等

摘要：

黄酮是具有2-苯基色原酮结构的化合物，1-脱氧野尻霉素（1-DNJ）是哌啶类多羟基生物碱，二者均为桑叶的主要有效成分，因其资源丰富、功效显著，近年来备受关注。本文综述了影响桑叶中黄酮与1-DNJ含量的因素及其检测方法。

关键词：桑叶；黄酮；1-DNJ；含量；检测方法

中图分类号：S888.2 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）04-0140-06

桑叶，为桑科植物桑（ Morus alba L.）的叶。味苦、甘，性寒，归肺、肝经，具有疏风散热、清肺润燥、清肝明目的功能，是一种常用中药[1]。桑叶的主要有效成分有黄酮类、生物碱、植物甾醇、γ-氨基丁酸、桑叶多糖等，其中研究最多的是黄酮和1-脱氧野尻霉素（1-DNJ）。本文综述了桑叶中黄酮和1-DNJ含量的影响因素及其检测方法。

1 黄酮类化合物

黄酮类化合物（flavonoids）是一类存在于自然界的具有2-苯基色原酮（flavone）结构的化合物。它们分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具有碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄酮。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态（苷元）的形式存在。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方面起着重要作用。

桑叶黄酮类成分主要包括芦丁、槲皮素、异槲皮素和二氢山萘等，占桑叶干重的1%～3%。桑是植物界茎叶黄酮含量较高的一类植物。Kim[2]从桑叶中分离到9种黄酮类成分；Kayo[3]从桑叶的丁醇提取物中也分离到9种黄酮类化合物，其中芸香苷的含量最高；张雁冰等[4]从马桑叶的乙醇提取物中分离到山奈酚、槲皮素等9种黄酮类化合物；杨燕等[5]从长穗桑的乙醇提取物中分离到3种黄酮类化合物；刘利等[6]从桑叶中提取、分离、鉴定了3种黄酮类化合物。

1.1 含量影响因素

桑叶中黄酮的含量与桑品种、产地、季节以及叶位等都有显著相关性。

1.1.1 品种刘利等[7]研究表明，长穗桑、华桑叶片总黄酮含量分别为63.92、61.17 mg/g，极显著高于其它桑种，白桑则极显著低于其它桑种。郭小补等[8]的试验结果表明，总黄酮含量最高的品种是粤诱33，质量分数为3.92%，最低的是云桑一号，仅为0.76%。刘春莲等[9]研究发现，桐乡青的黄酮平均含量最高，新一之濑次之，湖桑32最低。

张军等[13]报道显示，湖桑9001的芦丁含量是湖桑32的2倍，是白桑、鸡桑、广东桑的4倍；而槲皮素的含量则是湖桑32最高，鸡桑最低。吴好好等[16]发现，湖桑197、农桑14号、盛东1号的绿原酸较高，果桑大10的芦丁含量较高，湖桑197、盛东1号的异槲皮苷较高，果桑大10的芦丁含量大于异槲皮苷，而其他品种则是异槲皮苷高于芦丁。马合木提·买买提明等[27]研究表明，新疆药桑叶芦丁和异槲皮苷的含量较高，槲皮素的含量较低，芦丁和异槲皮苷的含量是槲皮素含量的3倍。

1.1.2 产地张如松等[10]检测了9个产地的桑叶，其中以临安产的桑叶中黄酮类成分含量最高，嘉兴的最低。穆春旭等[11]的试验结果显示，各产地的桑叶黄酮含量由高到低依次为山东、辽宁、河南、浙江、重庆。孟磊等[12]的结果表明，新疆吐鲁番地区的桑叶黄酮含量最高，其次是和田的黑桑，阿克苏地区的含量最低。

1.1.3 季节多数人认为冬季桑叶的黄酮含量较高，这也是中药采用霜桑叶的原因之一。孙敏耀等[15]发现，9月份采收的桑叶黄酮含量最高，7月份最低。徐健飞等[14]的结果表明，桑树生长前期黄酮含量较低，桑树停止生长后到晚秋后的这段时间较高。张军等[13]研究发现，同一产地桑叶中的芦丁和槲皮素以6月份采摘的含量较低，10月份达到最高。吴好好等[16]研究发现，绿原酸在冬季桑叶中明显高于春夏秋，而芦丁和异槲皮素则是冬季高于春季或与之持平并大大超过夏秋季。

1.1.4 叶位杨普香等[17]的结果表明，桑叶黄酮类化合物含量随叶位的降低或叶质的变老而逐步减少，桑芽中的含量介于1～3位叶与4～6位叶之间。刘春莲等[9]发现，桑树嫩头的黄酮类化合物含量较高，下部叶片较少。

另外，黄酮种类不同，其随品种、产地、季节与叶位变化的规律也不同。

1.2 含量检测方法

1.2.1 分光光度法分光光度法是目前应用较普遍的一种方法，操作简便，结果可靠，重复性好。紫外-可见分光光度法是在检测桑叶黄酮时应用最多的方法，标准品一般采用芦丁，波长多采用510 nm，样品提取主要有水提法和醇提法两种，甲醇与乙醇的提取效率相近[19]。超声提取明显优于索氏提取与水煮提取[18]，以70%乙醇超声提取45 min效果最好[20]，但70%乙醇超声提取 60 min的含量最高[11]。

荧光分光光度法操作简便、快速、准确，灵敏度高。一般以芦丁为标准品，乙醇作溶剂，缓冲液为醋酸-醋酸钠。王艳[21]报道，其激发和发射波长分别为436 nm和483 nm；而阿布都许库尔·吐尔逊等 [22]则认为，激发波长297 nm、发射波长432 nm较佳。

1.2.2 高效液相色谱法（HPLC）近年来，高效液相色谱法（HPLC）逐渐被运用到桑叶黄酮及其苷类化合物的检测中。该方法易于操作，有很高的准确度、精密度和很好的重复性、稳定性。目前研究中多采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC），色谱柱多选择C18柱，检测波长为360 nm左右。艾国民等[23]以乙腈-水为流动相，槲皮素为标准品；刘丽芳等[24]以芦丁、槲皮素为标准品，采用甲醇-0.5%磷酸溶液梯度洗脱；吴好好等[16]以绿原酸、芦丁、异槲皮苷为标准品，用90%乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱；吴秋生等[25]以芦丁、槲皮素为标准品，流动相分别采用四氢呋喃-磷酸和乙腈-醋酸缓冲液。endprint

1.2.3 高效毛细管电泳法（HPCE）该技术是一种高效分离分析技术，具有灵敏度高、柱效高、分析速度快、所需样品量少、溶剂消耗少和抗污染能力强等优点。检测波长多为245 nm，缓冲液可采用磷酸二氢钠-硼砂溶液[26]、Na2B4O7溶液[27]、含有15%甲醇的磷酸二氢钠-硼砂溶液等[28]。

在以上方法中，分光光度法因其操作简单且仪器较为普及而倍受欢迎。

2 1-DNJ

1-脱氧野尻霉素（ 1-deoxynojirimycin，1-DNJ）是存在于桑树等植物和微生物中的一种多羟基哌啶生物碱，也是桑叶生物碱中研究最多的一种，是一种极性含N化合物，化学名称是3， 4， 5-三羟基-2-羟甲基四氢哌啶，分子式为C6H13NO4，相对分子质量为163.17。1-DNJ 具有与α-1， 4-葡萄糖类似的结构，是α-葡糖苷酶抑制剂，具有降血糖功能，此外还具有抗肿瘤及抗病毒活性，因此引起国内外学者的普遍关注。

1976年Yagi等[29]首次从市售桑白皮即桑根皮中分离到天然DNJ，并定名为“moranoline” （mp 204～205℃，C6H13NO4），同时从新鲜的桑根、叶、皮等部位也能分离到，结构为（2R， 3R， 4R， 5S） -2-hydroxymethyl-3， 4， 5-trihydroxypiperidine）。日本学者Asano等[30]从桑叶中分离出多种多羟基生物碱，包括1-DNJ。至今科学家们已陆续从桑树的各生长部位分离发现了一系列DNJ及其衍生物。

2.1 含量影响因素

桑叶中的1-DNJ含量是随着桑品种、产地、季节、叶位以及环境条件不同而变化的。由于1-DNJ是桑叶的主要有效成分之一，因此，近年来有很多学者致力于1-DNJ含量影响因素的研究。

2.1.1 品种李有贵等[31]测定了云南省不同地区的 59 份野生桑叶，其中来自开远地区的岩桑1-DNJ含量高达 0.7911%。刘凡等[32] 检测了98 份桑树品种资源，结果表明4 个桑种间以及多倍体和二倍体桑树品种间没有显著差异，但不同品种间差异明显，其中白桑种的育 7803含量最高，为1.54 mg/g，另外广东桑种的黑皮桑、抗锈 2 和白桑种的阿2桑叶中1-DNJ 含量也较高。李化秀等[33]选取山东省内有代表性的17个桑品种进行1-DNJ检测，桑属不同种间与不同桑品种间均存在显著性差异，其中白桑最高，晋选6号和秋雨分别是鲁桑和白桑中含量最高的品种，分别为0.227%和0.3281%。

2.1.2 产地孟夏等[34]试验表明，不同产地1-DNJ含量差异较大，其中海南的琼41和陕西的猪桑含量最高，分别为0.344%和0.309%；而江苏的湖桑32号和新疆的疏勒白桑含量较少。鲁战会等[35]研究了全国9个蚕桑主产省区不同产地样品25份，结果最高的为陕西汉中，其次为江西宜春、广西合浦和山东潍坊，未发现与产地的关联性。

2.1.3 季节杨兵[36]和欧阳臻[37]等都认为4 月份1-DNJ含量较低，5 月份开始增高，到 7、8 月份含量最高，9、10 月份又降低，11 月份霜后的含量也变低，推测桑叶中 1-DNJ 含量可能与温度有关。关丽萍等[38]却认为在秋季采集的桑叶中1-DNJ含量较高。叶晶晶等[39]则认为，嫩芽和嫩叶中的含量以晚秋最高，成熟叶中以夏季最高，而老叶中的含量以春季最高。此外，不同发育阶段桑叶中含量的变化幅度以春季最小，晚秋变化最大。

2.1.4 叶位同一季节不同发育时期的1-DNJ含量均随叶位由高到低递减，嫩芽>嫩叶>成熟叶>老叶[39]。魏兆军等[40]的结果也表明，第 1 叶位至第 5 叶位1-DNJ的含量逐渐降低。

2.1.5 环境条件遮荫处理能显著增加桑苗叶片的1-DNJ 含量，在25%光强下处理5 d 时，桑苗叶片中1-DNJ 含量最高，达0.2043%；遮荫5 d 后继续遮荫对桑叶中1-DNJ 含量基本没有影响[41]。氮磷钾肥的施肥水平及其配比均能显著影响桑叶中1-DNJ质量分数，桑叶中总1-DNJ最佳经济产量为23.23 kg/hm2，推荐施肥指标氮为286.1 kg/hm2，五氧化二磷为95.2 kg/hm2，氧化钾为159.6 kg/hm2。

与黄酮不同的是，1-DNJ在温度较高季节、生长较为旺盛时期含量较高，若是侧重桑叶在降血糖上的应用应该考虑季节的因素。

2.2 检测方法

1-DNJ及其衍生物结构中含有较多羟基，属氮杂糖类，结构中没有苯环、双键、羰基等发色团，在可见光区和紫外光区都没有吸收，因此定性定量分析都较困难。

2.2.1 高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法是目前1-DNJ检测中使用较多的方法。一种是不需要进行衍生化，可以借助特殊检测器直接检测1-DNJ，如蒸发光散射检测器（ELSD）、示差折光检测器、质谱等。ELSD最大的优越性在于能检测不含发色团的化合物，并在没有标准品或者化合物结构参数未知的情况下检测未知化合物，简便、快捷，重现性好，灵敏度高。姜永涛[43]、宋婕[44]、陈正收[45]等均采用此法对1-DNJ进行了检测，色谱柱均采用NH2柱，流动相均为乙腈-水，ELSD漂移管温度为50℃左右。示差折光检测器是一种高度稳定和灵敏的色谱检测器，可用于检测在紫外光范围内吸光度弱的化合物。欧阳华学等[47]采用的色谱柱为Zorbax Carbohydrate，流动相为乙腈-水，该方法简便、快速。高效液相色谱-串联四级杆质谱联用（HPLC-MS/MS）选择性强、灵敏度高。戴开金等[46]以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相， SHIMADZU HRC-NH2柱分离，质谱条件为：采用大气压化学电离源（APCI）， 164.1/146.1、164.1/110.2两对离子，多反应监测（MRM）。endprint

另一种是1-DNJ需要进行柱前衍生化反应，然后利用紫外-可见检测器、荧光检测器以及二极管阵列检测器等进行检测。荧光检测器具有灵敏度极高、结果更准确、可靠等优点，欧阳臻等[50]用芴甲氧酰氯（FMOC-Cl）与 1-DNJ 反应生成荧光产物，色谱柱为C18分析柱及 ODS3 预柱，流动相为乙腈-0.1% 醋酸，荧光检测器激发波长254 nm，发射波长322 nm。谢慧明等[51]采用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（AQC）进行衍生化，激发波长为250 nm、发射波长为395 nm。紫外检测法虽不及荧光检测法的灵敏度高，但是由于检测器相对便宜，一般的高效液相色谱仪均有配备，因此更易于推广普及。施新琴等[48]用9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC）为衍化剂，在pH 8.5的硼酸盐缓冲液中进行衍生化反应，色谱柱为C18柱，检测波长为254 nm，流动相为乙腈-0.1%醋酸水溶液。张旻[49]则采用2， 4-二硝基氟苯（DNFB）进行衍生化反应，流动相为乙腈-0.1%醋酸甲醇，检测波长355 nm。二极管阵列检测器，也称PDA（photo-diode array）、PDAD（photo-diode array detector）或DAD（diode array detector）。陈正收等[45]采用C18为色谱柱，乙腈-0. 1%醋酸溶液为流动相，检测波长为265 nm 。

上述检测器中蒸发光散射检测器（ELSD）、示差折光检测器、质谱以及荧光检测器与紫外检测器相比，适用范围相对狭窄、价格相对昂贵，一般高效液相色谱仪上较少配置，故在应用普及方面不及紫外检测器范围广。

2.2.2 气相色谱法该法先将1-DNJ乙酰化成沸点较低的酯类，再采用气相色谱法检测。该方法操作简便，能够快速、准确检测出桑叶中的1-DNJ含量。汪孟夏[52]采用色谱柱OV-1701，检测器温度310℃，氢气流量47 mL/min。李宏等[53]则采用色谱柱DB-5，检测器温度260℃，氢气流量60.0 mL/min。

2.2.3 分光光度法分光光度法被广泛应用于不同物质的含量测定，1-DNJ本身无紫外-可见光吸收，但与显色剂碘-碘化钾混合后，其吸收光谱发生了变化，在334 nm处，一定浓度范围内，其吸光度与1-DNJ浓度符合Lambert-Beer定律，据此可用分光光度法测定桑叶中1-DNJ含量。杨海霞[54]、黎欢吉[55]等用阳离子交换层析法纯化桑叶中的1-DNJ，并采用紫外-可见分光光度计对桑叶中1-DNJ含量进行了测定。胡瑞君等[56]利用微波辅助提取技术提取桑叶中的1-DNJ，采用分光光度法测定 1-DNJ 含量。但由于1-DNJ本身没有颜色，其它少量色素的存在就可能对溶液的吸光度产生影响，所以较少采用分光光度计检测。

在以上的检测方法中，采用较多的是柱前衍生化后经高效液相色谱检测，检测器以常用的紫外和荧光检测器较多。

3 结语

黄酮与1-DNJ是目前桑中研究较多的成分，而能否提供一种快速、准确的测定方法是深入研究的首要条件，因此众多学者致力于各种检测方法的研究，以简便与准确为目标开发新的或改进原有的检测方法依然是今后的研究方向之一。关于产地对二者的影响方面，由于没有不同产地种植的同一桑品种黄酮与1-DNJ含量变化规律的报道，所以现有的关于产地的差异性结果，可能直接或间接地受到了品种、温度以及施肥情况的影响，具有一定的局限性，需要进一步研究。另外，进一步探明黄酮与施肥情况以及光照等环境因素的关系，以及影响桑叶中黄酮、1-DNJ等诸多活性成分含量的主导和非主导因素，都是今后的研究方向，这都将为以后进一步利用桑资源的药用价值提供理论依据，同时促进蚕桑产业的发展。

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