2株分离自黄龙冷水型水体中土著细菌的胞外有机酸代谢组分分析
2014-07-18李骐李琼芳王建萍马政庆包莉萍乔锐邓雄
李骐 李琼芳 王建萍 马政庆 包莉萍 乔锐 邓雄
摘要:对2株分离自黄龙冷水型水体的土著细菌020-18、021-3生长各阶段的胞外有机酸代谢组分进行了表征分析。结果表明:在迟缓期、对数期、稳定期及衰亡期等各个生长阶段,2菌株向胞外分泌7种有机酸的成分及含量各异;在对数期、稳定期生长阶段,2菌株在胞外积累了苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸。
关键词:高效液相色谱;细菌;有机酸;黄龙风景区
中图分类号: Q657.7+2文献标志码: A文章编号:1002-1302(2014)01-0274-04
收稿日期:2013-08-27
基金项目:国家自然科学基金主任基金(编号:41040004)。
作者简介:李骐言(1988—),女,福建龙岩人,硕士研究生,从事微生物研究。E-mail:leeqiyan@163.com。
通信作者:李琼芳,博士,副教授,主要从事微生物研究。E-mail:liqiongfang1992@126.com。黄龙风景区位于四川省阿坝藏族羌族自治州松潘县内,海拔3 145~3 578 m ,沟内钙华沉积长3.6 km,宽110~250 m,厚9~20 m,其独特的钙华沉积景观色彩绚丽,于1992年被联合国教科文组织列为世界自然遗产,是我国最为珍贵的自然景观之一。钙华景观的形成主要是CaCO3—H2O—CO2三相相互作用的结果[1]。目前国内众多学者对于钙、水的来源已经基本达成了共识[2],但对于CO2的来源主要存在2种观点,即冷成因论[3](或气候成因论)与热成因论[4](深成因论)。冷成因论认为,CO2主要来源于土壤及大气,认为生物成因、大气成因占主导作用;热成因论认为,CO2主要来自地球内部。钙化景区冷水型水体中土著微生物通过自身呼吸作用产生并释放的CO2作为灰岩的侵蚀溶解动力是很有可能的,但更为重要的是微生物能通过自身代谢产物(如有机酸、氨基酸、多糖、蛋白质等)对碳酸盐岩的沉积产生巨大影响。有学者认为,微生物碳酸盐岩沉积作用的发生主要是建立在胞外聚合物(EPS)、微生物膜(biofilm)、微生物席(microbial mat)等生物基础之上的[5-6]。微生物通过向胞外分泌EPS,不断捕捉及黏附钙离子,将微小晶粒附着于微生物膜(亚毫米级)上。微生物膜在捕捉、黏附的同时也可通过自身不断生长成更厚的微生物席(毫米级),进而对较大的沉积颗粒进行捕捉、黏附,最终形成微生物碳酸盐岩。近年来,国内外众多学者对微生物介导的碳酸盐岩沉积物进行了大量研究,肯定了碳酸盐岩沉积形成过程中微生物所起的重要作用。邢智峰等发现,在西云梦山组地层的纵剖面上,毫米级的深色沉积物层、浅色石英颗粒层交替出现,形成了典型的微生物席纹层,表明微生物在沉积表面发生多次生长、埋藏[7]。唐鑫萍等认为,山东省平邑盆地古近系湖相的3种微生物碳酸盐岩(核形石、叠层石、凝块石)是以微生物成因组构(EPS、微生物膜、微生物席)、微生物作用为共同基础在不同的环境条件下形成的[8]。Kenward等证实了白云石沉淀发生在异化型铁还原菌停止活动而产甲烷古菌新陈代谢活动繁盛后,证明产甲烷菌能够促进白云石在低温下沉淀[9]。Tong等研究发现,左旋天冬氨酸单体的添加对碳酸球文石晶型的形成具有特殊的调节作用[10]。周雪莹等发现,胶质芽孢杆菌在不同的培养条件下由于数量、荚膜多糖、碳酸酐酶活性的差异使得碳酸钙晶体的数量、形貌差异较大[11]。由此可见,微生物及其丰富的胞外代谢产物对碳酸钙晶体中晶型及形貌的影响不可忽视。本研究以探究黄龙风景区土著微生物胞外有机酸在钙华景观形貌形成中的参与程度为出发点,对黄龙风景区特殊冷水型水体中土著细菌在各个生长阶段所分泌的胞外有机酸组分进行了分析,旨在为揭示黄龙风景区钙华景观形成的生物成因提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株从黄龙冷水型水体中分离筛选出2株具有较大荚膜的细菌菌株(编号:020-18、021-3)。
1.1.2有机酸标准溶液精确称取草酸0.05 g,乳酸、冰乙酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸各0.5 g。用超纯水溶解并定容至100 mL容量瓶,得到混合标准酸储备液,密封并于4 ℃冰箱中保存待用。
1.2方法
1.2.1生长曲线的绘制挑取2环菌体于盛有100 mL牛肉膏蛋白胨培养基的三角瓶中(250 mL),于150 r/min、30 ℃恒温培养箱中振荡培养36 h进行活化。按2.5%(V/V)接种量分别将菌体接种于盛有牛肉膏蛋白胨培养基的三角瓶中,以无菌培养基作为空白对照,每6 h取样测定菌液D600 nm值,重复3次,绘制菌株的生长曲线。
1.2.2培养液的预处理按2.5%(V/V)接种量分别将菌体接种于盛有牛肉膏蛋白胨培养基的三角瓶中,振荡培养条件同上。定时对不同生长时段(迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期)的培养液进行取样,并于10 000 r/min、4 ℃下低温冷冻离心10 min,收集上清液,用0.45 μm微孔过滤待用。
1.2.3标准曲线的绘制取混合酸储备液依次稀释2、10、20、100倍,得到乙酸浓度分别为5 000、2 500、500、250、50 mg/L 的标准混酸溶液,密封并于4 ℃冰箱保存待用。
1.2.4色谱条件美国Agilent 1260高效液相色谱仪,ZORBA SB-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),柱温30 ℃,检测波长为 205 nm;流动相为pH值为2.45的3% CH3OH-0.05 mol/L Na2HPO4(V/V)缓冲溶液,流速为1.0 mL/min。
2结果与分析
2.1菌株荚膜染色
菌株020-18、021-3荚膜染色后于油镜下观测结果见图1,可见2菌株菌体细胞周围包裹了1层荚膜。endprint
2.2生长曲线
由图2、图3可见,菌株020-18迟缓期并不明显,6 h便已经进入对数期,20 h进入稳定期。菌株021-3具有明显的迟缓期(0~10 h),12 h进入对数期,20 h左右进入稳定期。由于本试验以吸光度为表征依据,衰亡期虽多数菌体已死亡,但悬浊度仍然维持一定水平,故吸光度变化不大。最终确定菌株020-18生长各时段培养时限分别为:迟缓期6 h、对数期18 h、稳定期30 h、衰亡期72 h;菌株21-3生长各时段培养时限分别为:迟缓期12 h对数期18 h、稳定期24 h、衰亡期54 h。
2.3液相色谱条件的确定
2.3.1测定波长及缓冲溶液的选取将标准混酸溶液进样后进行全波长扫描,发现205、210、215 nm处波长对7种有机酸吸收均较好,选取分离效果最好的205 nm作为检测波长。高效液相色谱测定有机酸试验多用磷酸盐或甲醇/乙腈-磷酸盐缓冲液体系进行洗脱分离。磷酸盐体系下各有机酸分离洗脱时间较长,但添加甲醇、乙腈后,不仅可以缩短各酸保留时间,还可以调整改善各有机酸峰型,减少拖尾。预试验发现:3% CH3OH-0.05 mol/L Na2HPO4(V/V)缓冲体系在pH值为2.45条件下能较好地对各有机酸进行分离。
2.3.2柱温、流速有机酸在缓冲液中的解离程度随着温度的升高而增加,不利于有机酸的分离,较高的温度也会使有机酸分离效果变差[12],因此本试验选择30 ℃作为分离柱温,最终选择流速为1 mL/min。
2.4有机酸标准图谱
在已确定的色谱条件下对7种混酸溶液进行分离,色谱分离图谱见图4。
有机酸标准色谱图上共出现8峰,可知从混合酸标准溶液中共分离了8种物质,除已知的7种有机酸外,必然存在1峰为杂质峰。分别配置浓度均为5 mg/L的7种有机酸的单一标准溶液,依次进样分析,发现第7峰为杂质峰。
2.5有机酸标准曲线绘制
将稀释倍数分别为100、20、10、2倍的标准混酸溶液依次进样,计算不同浓度下各有机酸的峰面积,并进行线性回归。由表1可知,各有机酸含量线性方程回归良好。
表1各有机酸线性相关分析
有机酸1浓度范围
(mg/L)1线性回归方程1决定系数草酸15~5001y=7.575 1x+11.7691r2=0.999 8酒石酸150~5 0001y=0.918 4x+41.0031r2=0.999 8苹果酸150~5 0001y=0.516 9x+23.9851r2=0.999 9乳酸150~5 0001y=0.394 2x-0.485 51r2=1.000 0乙酸150~5 0001y=0.334 7x+0.220 31r2=1.000 0柠檬酸150~5 0001y=0.613 4x+1.080 01r2=1.000 0琥珀酸150~5 0001y=0.351 1x-0.243 51r2=1.000 0
2.6菌株各时期的有机酸的测定
在已确定的色谱条件下对菌株020-18、021-3各生长时期胞外发酵液中7种有机酸进行色谱分离,其中020-18、021-3对数期分离结果见图5、图6。
牛肉膏蛋白胨培养基本身含有一定量的上述各有机酸,故考察菌株各生长时期胞外有机酸代谢量时,需扣除培养基中各有机酸本底值,当有机酸代谢量为负数时,表明菌株在生长代谢过程中消耗了有机酸。
由表2可知,菌株020-18在生长初期开始消耗草酸、乙酸,且需求量随着培养时间的延长不断增大;酒石酸、苹果酸在菌体生长初期有一定积累,随着培养时间的延长不断被消耗;随着培养时间的延长,乳酸含量呈现先增加后下降趋势,在对数期达到最大值59.951 mg/L;随着培养时间的延长,柠檬酸含量呈现增加—下降—增加趋势,在衰亡期达到最大值2 111.145 mg/L。
mg/L,衰亡期含量增加;菌体生长初期,酒石酸含量达到最大值408.375 mg/L,随着培养时间的延长,含量呈先降低后升高趋势;菌体对数生长期对苹果酸的消耗较大,随着培养时间的延长,稳定期苹果酸含量达到最大值,随后含量下降;随着培养时间的增加,乳酸含量逐渐增大,54 h达到最大值2 412.68 mg/L;菌体生长初期乙酸含量达到最大值1 695.052 mg/L,进入对数期后含量陡然下降,随着培养时间的延长,衰亡期为 -2 678.12 mg/L。菌体整个生长过程中柠檬酸、琥珀酸含量皆呈现先增加后下降趋势,对数时期柠檬酸含量达最大值192.174 mg/L,琥珀酸在对数期、稳定期含量相对稳定。表3菌株021-3各生长时期胞外有机酸代谢量
时间
(h)1有机酸代谢量(mg/L)草酸1酒石酸1苹果酸1乳酸1乙酸1柠檬酸1琥珀酸12143.1001408.3751213.3661-31.66711 695.0521148.5521112.08818127.0671-43.0581-459.9851971.405145.2951192.17411 416.24524114.2221-359.06611 318.03912 368.2481-2 719.3301105.77611 306.00954140.0661-359.4461-161.31612 412.6801-2 678.1201-105.819172.461
3结论与讨论
三羧酸循环(TCA)普遍存在于动物、植物、微生物细胞中,不仅是机体在有氧条件下获得能量的主要代谢途径,其中间代谢产物更是合成某些重要有机物的必要前体物质,如α-酮戊二酸、草酰胺酸分别为谷氨酸、天冬氨酸的前体。微生物生长代谢过程中,利用培养基中的营养物质,在菌体细胞内通过TCA等途径不断合成多种有机酸,当积累到一定浓度时,胞内外电化学梯度、渗透压发生改变,有机酸通过跨膜运输等方式运输至胞外,并滞留于培养液中。最初培养基中碳源被分解利用形成丙酮酸,通过氧化脱羧方式生成乙酰CoA,并在线粒体中与起始底物草酰乙酸依次合成柠檬酸、琥珀酸、苹果酸等有机酸。在菌体生长初期,菌株020-18不同程度地合成并分泌酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸,随着培养时间的增加,苹果酸、琥珀酸、柠檬酸等TCA循环中间产物连同其他代谢有机酸(草酸、乙酸、酒石酸)被不同程度消耗。这可能是由于菌株020-18菌体细胞较大、荚膜较厚,除了大量利用培养基中的营养物质外,通过各代谢途径合成的有机酸随着营养物质的消耗殆尽也被不同程度重新摄入细胞加以利用,以满足机体生长所需。随着培养时间的延长,柠檬酸含量陡然增高,这可能与菌株利用碳源的偏好性及后期细胞内外环境剧烈改变有关,菌株020-18可能更偏向利用琥珀酸、乙酸、酒石酸等有机酸,导致重新摄入的以及通过TCA途径不断合成的柠檬酸暂时积累于菌体细胞内。随着衰亡期的到来,菌体逐渐趋向凋亡,细胞内外pH值、电化学梯度以及渗透压等环境因素发生剧烈变化,使得柠檬酸最终被大量释放到胞外培养液中。菌株021-3在整个生长过程中均不同程度地代谢7种有机酸,由于生长初期菌体繁殖量小,少量的柠檬酸、琥珀酸在菌体内合成并分泌到胞外。随着对数期的到来,大量乙酰CoA、草酰乙酸被消耗利用以合成ATP来维持菌体快速繁殖,导致经由TCA生成的琥珀酸、柠檬酸含量不断增加,随着衰亡期的到来,培养液中琥珀酸、柠檬酸含量呈下降趋势,这可能是由于菌体在衰亡期对柠檬酸、琥珀酸的合成减少,且二者作为菌株利用效能较高的碳源被重新摄入胞内利用所致[12]。对数期苹果酸被大量消耗,稳定期、衰亡期苹果酸含量变化趋势同柠檬酸、琥珀酸相似。随着培养时间的延长,乳酸含量不断增加,这同徐凯等的研究结果[13]一致。酒石酸含量随着培养时间的增加呈现先降低后增加趋势,与柠檬酸代谢趋势相反,这同杨文洲等的研究结果[14]类似。endprint
参考文献:
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