武爱玲 赵新杰

(1 河南省洛阳正骨医院，洛阳，471002； 2 河南省洛正制药厂，洛阳，471013)

中药研究

HPLC-ELSD测定黄芪生络复康丸中黄芪甲苷的含量

武爱玲1赵新杰2

(1 河南省洛阳正骨医院，洛阳，471002； 2 河南省洛正制药厂，洛阳，471013)

目的：采用HPLC-ELSD法建立黄芪生络复康丸中黄芪甲苷的含量测定方法。方法：色谱柱为Diamonsic C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(35∶65)为流动相，流速为1.0 mL·min-1，柱温为40 ℃。ELSD检测器，雾化器温度80 ℃，蒸发器温度100 ℃，载气流速1.5 mL·min-1。结果：黄芪甲苷进样量在1.62～8.10 μg时线性关系良好，r=0.999 9，平均加样回收率为99.08%(RSD=1.63%)。结论：本方法简便、准确、专属性强，可用于本品的质量控制。

HPLC-ELSD；黄芪生络复康丸；黄芪甲苷；含量测定

黄芪生络复康丸是本院的内部制剂，由黄芪、淫羊藿、丹参、赤芍、川芎、桃仁等药组成，具有补气益肾生髓，活血化瘀生络的作用，用于不完全性周围神经损伤及周围神经变性。原标准中采用薄层扫描法对黄芪甲苷进行含量测定[1]，因薄层扫描法含量测定重现性较低，操作繁琐，测定周期长。为了更有效地控制其产品质量，本文应用高效液相色谱法测定黄芪生络复康丸中黄芪甲苷的含量，并对其进行方法学考察。结果表明，该法简便快速，结果准确。

1 仪器与试药

shimadzu LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)，LC Workstation，配有四元梯度泵、在线脱气机、柱温箱、自动进样器；ELSD-2000ES型蒸发光散射检测器(美国Alltech公司)。AB135-S型梅特勒拖利多电子天平，METTLER AE200电子分析天平。黄芪甲苷对照品(批号：110781-200613)购自中国药品生物制品检定所。试剂均为分析纯。六批样品均由河南省洛阳正骨医院制剂科生产并提供。

2 方法与结果[2-13]

2.1 色谱条件 Diamonsic C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-水(35∶65)为流动相进行洗脱，流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃；ELSD检测器，雾化器温度80 ℃，蒸发器温度100 ℃，载气流速1.5 mL·min-1。色谱柱的理论塔板数以黄芪甲苷峰计不低于3 000。进样量：10 μL。

2.2 系统适用性试验 在选定条件下，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，且与其他相邻色谱峰分离度大于1.5。理论塔板数以黄芪甲苷峰计在3 000以上，而阴性对照在此保留时间无干扰(见图1)。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取在60 ℃真空干燥4 h的黄芪甲苷对照品适量，用甲醇溶解，制成每1 mL含黄芪甲苷700 μg的溶液作为对照品1，吸取对照品1溶液适量，甲醇稀释制成每1 mL含黄芪甲苷260 μg的溶液作为对照品2，即得。

图1 黄芪生络复康丸HPLC图谱

注：A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.黄芪甲苷

2.4 阴性对照液的制备 取缺黄芪的阴性样品，按供试品溶液的制备方法进行处理，制得阴性对照液。

2.5 供试品溶液的制备 取本品研细，取约5 g，精密称定，加水10 mL，微热溶解，转移至分液漏斗中，水饱和正丁醇40 mL，萃取4次，合并正丁醇层，再取氨试液40 mL，萃取2次，弃去氨水层。减压浓缩回收正丁醇至干，残渣用甲醇溶解定容于10 mL，摇匀，即得。

2.6 线性关系考察 精密称取黄芪甲苷对照品1 620 mg，置10 mL的棕色量瓶中，加甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀。精密吸取2.5，2.0，1.5，1.0，0.5 mL置5 mL的量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取10 μL进样，测定其峰面积，以黄芪甲苷进样量的对数为横坐标，以峰面积的对数为纵坐标，绘制标准曲线，进行回归分析，得黄芪甲苷的回归方程Y=0.998 7X+6.640 7，r=0.999 9，线性范围为1.62～8.10 μg。

2.7 精密度试验 精密吸取“2.3”项下对照品2溶液10 μL，重复进行5次，测定黄芪甲苷峰面积积分值。结果其相对标准差RSD为1.56%。

2.8 重现性试验 取同一批号供试品，按“2.5”项下方法制成供试品溶液5份，分别进样10 μL，测定黄芪甲苷峰面积积分值。结果RSD为1.38%。

2.9 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、6、8、10、12 h时进样，测定黄芪甲苷峰面积积分值。结果RSD为1.67%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.10 加样回收率试验 精密称取已测定含量的黄芪生络复康丸细粉(批号：120601)2.5 g，共6份，各加入黄芪甲苷浓度为1.402 mg/mL的混合对照液2 mL，分别用与“2.5”项下方法制得供试品溶液，各进样10 μL，进行测定，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率测定结果(n=6)

2.11 样品测定 取6个批号的样品，按“2.5”项下方法制成供试品溶液，分别精密吸取两个浓度的对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，外标两点法计算，即得。结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=2)

3 讨论

黄芪甲苷含量测定方法较多，主要有高效液相色谱法、薄层扫描法、比色法、荧光法等几大类方法[14]。但大多数制剂由于成分复杂，干扰严重；近年来，随着新型检测器ELSD的出现，使原本无紫外吸收的黄芪甲苷也得以很好的分离，HPLC法因操作简单、快速、灵敏度高、重现性好而优于其他方法。

黄芪生络复康丸是本院的内部制剂，原标准中采用薄层扫描法对黄芪甲苷进行含量测定，工作中经常出现展开系统不稳定，分离效果欠佳的情况，另因薄层扫描法含量测定重现性较低，操作繁琐，测定周期长。故本方法采用了ELSD-HPLC法。

样品处理方法文献上有索氏提取脱酯后萃取法、超声提取后萃取法、大孔树脂提取法、KOH回流提取法、中性氧化铝柱法[15-16]。本研究分别比较了溶剂两相萃取、大孔吸附树脂和中性氧化铝柱3种方法。结果表明，大孔吸附树脂法在洗脱过程中易产生气泡，且保留率较低。中性氧化铝柱可吸附大部分水溶性及脂溶性杂质，能有效除去样品溶液中较多杂质，但操作繁琐。而溶剂萃取法操作简便，且能除去大部分杂质，使样品溶液得到较好的精制效果。故选用溶剂萃取法。

流动相的选择，考察了5种展开系统对黄芪生络复康丸中黄芪甲苷的分离及含量测定的影响。曾采用甲醇-水(80∶20)、甲醇-水(75∶25)、乙腈-水(30∶70)、乙腈-水(32∶68)、乙腈-水(35∶65)等不同流动相，结果测定流动相为乙腈-水(35∶65)时黄芪甲苷峰形良好，可达到基线分离，与相邻峰分离度较好。本试验也对柱温条件进行了考察，结果表明柱温在40 ℃时峰形较好。

ELSD检测器参数的确定：经多次试验，并按ELSD检测器设置要求，确定了雾化器温度80 ℃，蒸发器温度100 ℃，载气流速1.5 mL·min-1。因为温度过高或过低直接影响溶剂的挥发程度，进而影响基线的稳定性。

综上所述，本方法操作简便、结果准确，重复性好，加样回收率高，可用于黄芪生络复康丸的含量测定。

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(2013-05-29收稿 责任编辑：徐颖)

HPLC-ELSD Determination of Astragaloside in Huangqi Shengluo Fukang Pill

Wu Ailing1， Zhao Xinjie2

(1HenanLuoyangOrthopedic-TraumatologicalHospital，Luoyang471002，China; 2HenanLuozhengPharmaceuticalFactory，Luoyang471013，China)

Objective： To establish a content determination method of Astragaloside in Huangqi Shengluo Fukang Pill by HPLC-ELSD.Methods： The chromatographic Column Diamonsic C18(4.6mm×250mm，5μm)was set. The mobile phase consisted of acetonitrile and water (35：65)， and the flow rate was 1.0mL·min-1. The column temperature was 40℃，and the content was determined with evaporate light scattering detector (ELSD). The temperature of spray chamber was 80℃ and the temperature of evaporator was 100℃.The gas flow rate of parameter of ELSD was 1.5mL·min-1.Results： The linear range of Astragaloside was within 1.62 to 8.10μg (r=0.9999).The average recovery rate was 99.08%(RSD=1.63%. Conclusion： The established method is convenient and accurate and highly specific， and it can be used for the quality control of Huangqi Shengluo Fukang Pill.

HPLC-ELSD; Huangqi Shengluo Fukang Pill; Astragaloside; Determination

武爱玲(1978—)，女，河南省洛阳正骨医院，主管药师，硕士，主要从事医院制剂开发与研究工作

赵新杰(1972—)，男，河南省洛正制药厂，副研究员，地址：河南省洛阳市白马寺车站路北1号河南省洛正制药厂，E-mail：wal2317@163.com

R286.0

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.05.031