红掌FLOWERING LOCUS T同源基因的克隆及生物信息学分析
2014-07-18马广莹邹清成刘慧春周江华朱开元
马广莹+邹清成+刘慧春+周江华+朱开元
摘要：通过高通量测序技术获得红掌成花素基因FT，对其进行序列分析，通过与已报道同源基因的比较，预测基因FT能够显著促进转基因植物开花，为开展红掌分子育种提供了有益基因资源。
关键词：红掌；克隆；基因FT；信息学；序列分析
中图分类号： S682.03文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0031-02
收稿日期：2013-06-18
基金项目：国家自然科学基金（编号：31200527）；浙江省自然科学基金（编号：Q13C150011）。
作者简介：马广莹（1982—），男，山东梁山人，博士，助理研究员，从事园林植物引种栽培及遗传育种工作。E-mail：magypetunia@aliyun.com。为实现种群繁衍，植物必须在合适的时间进行生殖生长、开花结果。许多植物调整开花时间的方式是根据环境信号（如日照长短、温度等）来产生应答反应，植物内源激素和年龄这2个内部信号也可以诱导植物开花。近年来，通过对模式植物拟南芥的分子水平研究，人们总结出“光周期、春化、自主调控以及赤霉素”4条控制植物开花的途径[1-3]。FLOWERING LOCUS T基因（FT基因）是学术界普遍认可的成花素，于叶片中合成，然后通过韧皮部运输到顶端分生组织，FT与FD基因互作，诱导下游成花基因的表达，促进开花[4-5]。
拟南芥（Arabidopsis thaliana）中存在6类FT-like基因，都可能参与了成花诱导，这些基因有着共同的PEPB结构域[6]。本研究经转录组测序，克隆到了1个红掌（Anthurium andraeanum）PEPB基因，通过序列对比等生物信息学分析，确定该基因是1种促进开花的功能基因，这为今后通过转基因手段培育矮化的早花红掌品种、缩短红掌育种年限提供了重要的资源。
1材料与方法
1.1试验材料
红掌品种为“阿拉巴马”，取盛花期植株幼嫩叶片、苞片、花序3个组织进行混合，按照美国Invitrogen公司生产的植物RNA提取试剂盒（货号：12322-012）提取总RNA，构建Illumina文库，并委托上海美吉生物公司采用Illumina Hiseq 2000对文库进行测序。
1.2序列分析软件及分析方法
通过测序获得的基因序列，经过NCBI 网站ORFFinder软件进行编码区预测，然后用http：//prosite.expasy.org/网站进行编码区氨基酸序列预测，并进行序列保守结构域的检索[7]，采用DNAMAN软件进行多序列氨基酸比对，采用MEGA5进行多物种FT基因进化关系分析[8]，建树方法为Neighbor-joining，bootstrap 1 000次。
2结果与分析
2.1红掌FT基因获得
通过测序，获得了与水稻FT基因相似度较高的1条EST序列，通过比对分析，初步确定其为红掌FLOWERING LOCUS T基因的同源物，命名为AaFT。如图1所示，该基因编码区核苷酸序列有525 bp，其余部分为UTR区域。用该区域序列进行氨基酸推测，得到了174个氨基酸残基。
2.2AaFT基因生物信息学分析
通过在线软件分析，不仅推测出该基因的氨基酸序列，还找到了该序列中存在PBP结构域所在的位置，该结构域共计23个氨基酸残基，序列为YTLVMVDPDAPSPSDPNLREYLH，起始位置为64～86号氨基酸。
为了更好地分析该基因的保守性及与同类基因的相似度，将其与拟南芥FT基因（AtFT）进行序列比较。由图2可见，拟南芥与红掌FT基因的序列相似度比较高，二者在FT基因关键氨基酸残基上有着相同的组成，即第85、140号氨基酸残基分别为酪氨酸、谷酰胺。
用MEGA软件构建了6种不同物种FT基因的进化树。从图3可见，单、双子叶植物FT基因同源性差异明显，属于单子叶植物的红掌与水稻（Oryza sativa，登录号：AB052943.1）、蕙兰（Cymbidium faberi，登录号：KC138734.1）、蝴蝶兰（Phalaenopsis hybrid，登录号：KC138805.1）、小麦（Triticum aestivum，登录号：AY705794.1）亲缘关系较近，聚类时容易聚在一起，而红掌FT基因与拟南芥相比，亲缘关系则明显较远，这也与二者分属单、双子叶植物类别相对应。
3小结与讨论
FT基因作为成花素，受到广泛关注，目前，已经有非常多植物的FT基因被成功克隆出来，在促进植物开花方面表现十分优异[9]。红掌作为国内外重要的高档盆栽花卉，目前育种工作主要集中在常规杂交育种方面，分子育种刚刚起步，红掌FT基因的克隆为通过转基因手段快速培育红掌新品系、缩短杂交育种年限提供了有利条件，也为微型红掌品种的开发提供了可能。
本试验通过高通量测序技术获得了1条包含完整编码框的FT基因序列，通过比对及生物信息学分析，确定该基因为红掌FT同源基因。前人研究证明，FT基因家族存在着序列高度相似、功能完全相反的成员——TFL[10-11]，但是二者在关键氨基酸组成上存在着明显区别，通过比较分析，本研究所克隆的基因序列在85号及140号氨基酸组成上与拟南芥促进早花的FT基因完全一致，结合相似序列，确定该基因是FT基因，其功能应该是促进植物开花，而非抑制植物开花。
用红掌FT基因与拟南芥比较，虽然二者分属于单、双子叶植物类别，但是两基因在氨基酸组成的高度相似说明了FT基因在进化过程中保持着稳定性，这可能是其发挥早花功能的必备条件。与多物种FT基因进行聚类分析，发现红掌FT基因与其他单子叶植物之间存在着较大遗传距离，说明FT基因虽然功能上保持着稳定性，但随着物种的进化而不断发生变异，深入研究该基因及其家族成员，有利于解析不同物种的进化模式。
参考文献：
[1]Simpson G G，Gendall A R，Dean C. When to switch to flowering[J]. Annual Review of Cell and Developmental Biology，1999，15（1）：519-550.
[2]Reeves P H，Coupland G. Response of plant development to environment：control of flowering by daylength and temperature[J]. Current Opinion in Plant Biology，2000，3（1）：37-42.
[3]Simpson G G，Arabidopsis D C. Arabidopsis，the rosetta stone of flowering time[J]. Science，2002，296（5566）：285-289.
[4]Abe M，Kobayashi Y，Yamamoto S，et al. FD，a bZIP protein mediating signals from the floral pathway integrator FT at the shoot apex[J]. Science，2005，309（5737）：1052-1056.
[5]Hanzawa Y，Money T，Bradley D. A single amino acid converts a repressor to an activator of flowering[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（21）：7748-7753.
[6]Chardon F，Damerval C. Phylogenomic analysis of the PEBP gene family in cereals[J]. Journal of Molecular Evolution，2005，61（5）：579-590.
[7]Artimo P，Jonnalagedda M，Arnold K，et al. ExPASy：SIB bioinformatics resource portal[J]. Nucleic Acids Research，2012，40：W597-W603.
[8]Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731-2739.
[9]Kotoda N，Hayashi H，Suzuki M，et al. Molecular characterization of FLOWERING LOCUS T-like genes of apple（Malus domestica Borkh.）[J]. Plant & Cell Physiology，2010，51（4）：561-575.
[10]Ahn J H，Miller D，Winter V J，et al. A divergent external loop confers antagonistic activity on floral regulators FT and TFL1[J]. Embo Journal，2006，25（3）：605-614.
[11]Mimida N，Goto K，Kobayashi Y，et al. Functional divergence of the TFL1-like gene family in Arabidopsis revealed by characterization of a novel homologue[J]. Genes to Cells，2001，6（4）：327-336.
参考文献：
[1]Simpson G G，Gendall A R，Dean C. When to switch to flowering[J]. Annual Review of Cell and Developmental Biology，1999，15（1）：519-550.
[2]Reeves P H，Coupland G. Response of plant development to environment：control of flowering by daylength and temperature[J]. Current Opinion in Plant Biology，2000，3（1）：37-42.
[3]Simpson G G，Arabidopsis D C. Arabidopsis，the rosetta stone of flowering time[J]. Science，2002，296（5566）：285-289.
[4]Abe M，Kobayashi Y，Yamamoto S，et al. FD，a bZIP protein mediating signals from the floral pathway integrator FT at the shoot apex[J]. Science，2005，309（5737）：1052-1056.
[5]Hanzawa Y，Money T，Bradley D. A single amino acid converts a repressor to an activator of flowering[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（21）：7748-7753.
[6]Chardon F，Damerval C. Phylogenomic analysis of the PEBP gene family in cereals[J]. Journal of Molecular Evolution，2005，61（5）：579-590.
[7]Artimo P，Jonnalagedda M，Arnold K，et al. ExPASy：SIB bioinformatics resource portal[J]. Nucleic Acids Research，2012，40：W597-W603.
[8]Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731-2739.
[9]Kotoda N，Hayashi H，Suzuki M，et al. Molecular characterization of FLOWERING LOCUS T-like genes of apple（Malus domestica Borkh.）[J]. Plant & Cell Physiology，2010，51（4）：561-575.
[10]Ahn J H，Miller D，Winter V J，et al. A divergent external loop confers antagonistic activity on floral regulators FT and TFL1[J]. Embo Journal，2006，25（3）：605-614.
[11]Mimida N，Goto K，Kobayashi Y，et al. Functional divergence of the TFL1-like gene family in Arabidopsis revealed by characterization of a novel homologue[J]. Genes to Cells，2001，6（4）：327-336.
参考文献：
[1]Simpson G G，Gendall A R，Dean C. When to switch to flowering[J]. Annual Review of Cell and Developmental Biology，1999，15（1）：519-550.
[2]Reeves P H，Coupland G. Response of plant development to environment：control of flowering by daylength and temperature[J]. Current Opinion in Plant Biology，2000，3（1）：37-42.
[3]Simpson G G，Arabidopsis D C. Arabidopsis，the rosetta stone of flowering time[J]. Science，2002，296（5566）：285-289.
[4]Abe M，Kobayashi Y，Yamamoto S，et al. FD，a bZIP protein mediating signals from the floral pathway integrator FT at the shoot apex[J]. Science，2005，309（5737）：1052-1056.
[5]Hanzawa Y，Money T，Bradley D. A single amino acid converts a repressor to an activator of flowering[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（21）：7748-7753.
[6]Chardon F，Damerval C. Phylogenomic analysis of the PEBP gene family in cereals[J]. Journal of Molecular Evolution，2005，61（5）：579-590.
[7]Artimo P，Jonnalagedda M，Arnold K，et al. ExPASy：SIB bioinformatics resource portal[J]. Nucleic Acids Research，2012，40：W597-W603.
[8]Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731-2739.
[9]Kotoda N，Hayashi H，Suzuki M，et al. Molecular characterization of FLOWERING LOCUS T-like genes of apple（Malus domestica Borkh.）[J]. Plant & Cell Physiology，2010，51（4）：561-575.
[10]Ahn J H，Miller D，Winter V J，et al. A divergent external loop confers antagonistic activity on floral regulators FT and TFL1[J]. Embo Journal，2006，25（3）：605-614.
[11]Mimida N，Goto K，Kobayashi Y，et al. Functional divergence of the TFL1-like gene family in Arabidopsis revealed by characterization of a novel homologue[J]. Genes to Cells，2001，6（4）：327-336.
