APP下载

马尾松不同部位中莽草酸的含量分析

2014-07-16程兰香等

江苏农业科学 2014年3期
关键词:高效液相色谱含量测定马尾松

程兰香等

摘要:采用蒸馏水加热回流提取马尾松不同部位中的莽草酸,用高效液相色谱法测定其莽草酸含量,并比较了不同树龄的马尾松松针中的莽草酸含量。结果表明:马尾松成熟松针中莽草酸的含量高于其他部位,最高为3.289%,老树皮中莽草酸含量最低,为0.04%;随着树龄的增长,松针中莽草酸含量逐渐减少,其中树龄为5年的马尾松松针中莽草酸含量最高,为3.435%,树龄为10年的马尾松松针次之,为3.274%。综合考虑,树龄为10年的马尾松成熟松针具有较高开发价值。

关键词:马尾松;莽草酸;含量测定;高效液相色谱

中图分类号: O657.7+2;R284.1 文献标志码: A 文章编号:1002-1302(2014)03-0260-03

马尾松(Pinus massoniana)是我国松属树种地理分布最广的一种,广泛分布于我国亚热带东南部湿润区,其生态环境复杂,变幅很大,是中国最重要的常见树种之一[1]。松树药用的代表部位是松针,松针的药用成分高于松树的其他部位,不但含有大量生物黄酮类物质、莽草酸、木脂素,还富多种维生素,现代研究表明松针提取物具有抗氧化、抗突变、降血脂、降血糖等功能[2-4]。

莽草酸,化学名为3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-甲酸,是一种易溶于水的白色精细粉末,是各种芳香族化合物的来源,也是一些次生代谢产物的重要原料。莽草酸通过影响花生四烯酸代谢,可作为抗病毒和抗癌药物中间体,不仅抑制动、静脉血栓及脑血栓形成,还能抑制血小板聚集,具有抗炎、镇痛作用[5]。

莽草酸最早是从有剧毒的日本八角茴香花朵中分离出来的。在美国大量分布的北美枫香树的树叶和种子中也含有莽草酸,种子中其含量为3.7%[6]。据国外研究报道,几种松树如冷杉、云杉等的针叶中含有莽草酸,欧洲赤松松针中莽草酸含量为1.6%[7]。国外对于马尾松松针中莽草酸的提取与测定几乎没有报道。目前,中国八角茴香是莽草酸主要的提取来源,其含量高达10%左右,但是仅从八角茴香里提取,无法满足市场对莽草酸的需求,而且提取成本高[8]。此外,莽草酸还可以通过微生物代谢、化学合成、微生物生物转化来产生[9]。据报道,马尾松松针中也含有莽草酸,国内对于马尾松松针中莽草酸的提取与测定研究报道较多,但对马尾松不同部位的莽草酸含量测定报道较少,对不同树龄的马尾松松针中莽草酸含量测定尚未报道。为了更合理充分地开发和利用马尾松资源,筛选更理想的莽草酸提取原料资源来源,科学地实现自然生态建设与资源高效开发利用,对生态林中马尾松不同部位与不同树龄的马尾松松针中莽草酸含量进行了研究分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马尾松样品,采集于贵州省贵阳市花溪区自然生态林;莽草酸标样(贵州迪大生物有限公司,纯度≥98%);乙腈为色谱纯,其他试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器

LC-10Avp高效液相色谱仪(日本岛津公司);RE-52旋转型蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);FA2004N电子天平(上海菁海仪器有限公司);SHZ-Ⅲ循环水式真空泵(上海亚荣生化仪器厂);电动离心机(常州澳华仪器有限公司);HH-6数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 标样储备液的制备 精确称取干燥至恒重的莽草酸标样10.0 mg,置于100 mL容量瓶中用超纯水溶解并定容至刻度,摇匀,即得浓度为0.1 mg/mL的标样储备液。

1.3.2 样品供试液的制备 精确称取已干燥粉碎(过60目筛)的马尾松样品(马尾松各部位样品均来自同一条件下的原料,不同树龄的松针均为成熟松针)2.0 g于圆底烧瓶中,加入40 mL蒸馏水95 ℃下回流提取2.5 h。提取液过滤,离心,在减压水浴装置下浓缩,将浓缩液倒入100 mL容量瓶中用超纯水定容至刻度。从容量瓶中移取1 mL提取液于 25 mL 容量瓶中用超纯水定容至刻度,临用前用0.45 μm微孔滤膜过滤。

莽草酸含量=提取液中莽草酸的质量/样品的质量×100%。

1.3.3 色谱条件 岛津LC-10Avp型高效液相色谱仪,SPD-10Avp 检测器。色谱柱:Shodex Asahipak NH2(5 μm,4.6 mm×250 mm);流动相:乙腈 ∶ 2%H3PO4(体积比 80 ∶ 20);流速:0.8 mL/min。测定波长213 nm,柱温40 ℃。对照品溶液和供试品溶液分别进样20 μL。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

精确量取莽草酸标样储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 分别置10 mL容量瓶中,加入超纯水稀释至刻度,摇匀,得系列质量浓度的对照品溶液,用0.45 μm微孔滤膜过滤待用。分别精确吸取莽草酸对照品溶液20 μL注入色谱仪,测得峰面积。以标样峰面积(y)对浓度(x)进行线性回归分析,求出回归方程:y=62 882x+21 111,r2=0.999 7,在500~30.00 μg/mL的范围内,莽草酸浓度对峰面积有良好的线性关系。

2.2 精密度试验

精确吸取莽草酸标样溶液(20.00 μg/mL)20 μL,重复进样5次,测定色谱峰峰面积分别为1 275 831、1 274 462、1 260 014、1 286 493、1 270 026,其RSD为0.767%,精密度良好,符合分析要求。

2.3 重复性试验

称取马尾松松针粉末(树龄为10年左右的成熟松针,过60目)2.0 g,按样品测定法重复测定5次,测得莽草酸含量分别为3.228%、3.197%、3.288%、3.256%、3.19%,平均值为3.262%,RSD为1.216%,重复性良好,符合分析要求。endprint

2.4 稳定性试验

取松针供试液,在“1.3.3”节色谱条件下,于0、4、8、12、24 h分别测定莽草酸峰面积,分别为1 645 591、1 630 190、1 655 802、1 649 043、1 638 921,计算峰面积的RSD为0769%,表明样品供试液在24 h内稳定性良好。

2.5 加样回收试验

精确称取已知含量的马尾松松针粉末2.0 g,共5份,分别精确加入规定量的莽草酸标样,按样品供试液制备及测定法操作,分别进行色谱分析,其平均回收率为97.621%,RSD为0.949%,符合分析要求,结果见表1。

3 讨论与结论

3.1 样品的预处理以及提取溶剂的选择

据文献报道,莽草酸随着松针存放时间的延长而逐渐减少,可能是因为在莽草酸激酶的作用下,松针中的莽草酸经莽草酸途径代谢生成多种芳香族化合物,为了避免莽草酸的代谢转化,采集的马尾松松针样品应该及时烘干[10]。

莽草酸是小分子有机弱酸,易溶于水,在水中的溶解度为 180 g/L,难溶于三氯甲烷、苯和石油醚,并且水的成本较低,提取后无有害有机溶剂残留,经济环保,所以采用水作为提取溶剂。

3.2 样品中莽草酸提取工艺的优化

精确称取同一批马尾松样品干燥粉末2.5 g,对影响莽草酸提取效率的4个因素进行考察,设计4因素3水平的正交试验,即提取时间(1.5、2、2.5 h)、提取温度(75、85、95 ℃)、料液比(1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25)及原料粒度(40、60、80目)。试验结果表明:提取时间为2.5 h,提取温度为95 ℃,料液比为1 ∶ 20,粒度为60目,提取效率最高。

3.3 方法的确定与含量分析

采用HPLC法测定马尾松样品中莽草酸的含量,该方法准确性、精确度和重复性良好,适合测定松针及其他天然植物中莽草酸的含量。由结果分析可知,马尾松的成熟松针具有较高的开发价值,在不同树龄的马尾松中,数龄为10年的马尾松适合开发利用,可以在不破坏植被的情况下最大限度地利用自然资源。

3.4 研究意义

本课题研究对资源的开发和利用提供了研究方法和应用基础参考数据,对马尾松生态林的建设、资源开发、生态修复提供了科学依据,对资源利用的节约化和高效利用均具有重要的综合意义。对于松针中莽草酸的分离纯化、成品制取、提取后废料的资源再利用,本课题组正在进行进一步的深入研究。

参考文献:

[1]李 丹,彭少麟. 马尾松地理种源遗传变异规律研究的综述与分析[J]. 应用生态学报,2000,11(2):293-296.

[2]陈 英,刘成国,赵毓芝,等. 松针功能性成分及应用研究进展[J]. 安徽农业科学,2012,40(10):5994-5996.

[3]张 霞,孙爱东. 松针提取物的研究进展[J]. 中国食物与营养,2009(9):23-25.

[4]郑晓珂,王小兰,冯卫生. 松针提取物降血脂作用研究[J]. 中药药理与临床,2008,24(3):81-82.

[5]顾小文,朱开梅. 莽草酸及其衍生物医学作用的研究进展[J]. 医学综述,2013,19(6):1099-1101.

[6]Martin E,Duke J,Pelkki M,et al. Sweetgum (Liquidambar styraciflua L.): extraction of shikimic acid coupled to dilute acid pretreatment[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2010,162(6):1660-1668.

[7]Ghosh S,Chisti Y,Banerjee U C. Production of shikimic acid[J]. Biotechnology Advances,2012,30(6): 1425-1431.

[8]张中朋. 八角茴香、莽草酸生产市场概况[J]. 中国现代中药,2006,8(4):41-42.

[9]张军民,傅思武,石晓峰. 微生物代谢合成法在莽草酸及其衍生物研究中的应用[J]. 中国微生态学杂志,2013,25(1):91-93.

[10]张志琴,刘光明,杨永寿,等. 云南松松针中莽草酸的含量测定[J]. 云南民族大学学报:自然科学版,2012,21(1):10-12.endprint

2.4 稳定性试验

取松针供试液,在“1.3.3”节色谱条件下,于0、4、8、12、24 h分别测定莽草酸峰面积,分别为1 645 591、1 630 190、1 655 802、1 649 043、1 638 921,计算峰面积的RSD为0769%,表明样品供试液在24 h内稳定性良好。

2.5 加样回收试验

精确称取已知含量的马尾松松针粉末2.0 g,共5份,分别精确加入规定量的莽草酸标样,按样品供试液制备及测定法操作,分别进行色谱分析,其平均回收率为97.621%,RSD为0.949%,符合分析要求,结果见表1。

3 讨论与结论

3.1 样品的预处理以及提取溶剂的选择

据文献报道,莽草酸随着松针存放时间的延长而逐渐减少,可能是因为在莽草酸激酶的作用下,松针中的莽草酸经莽草酸途径代谢生成多种芳香族化合物,为了避免莽草酸的代谢转化,采集的马尾松松针样品应该及时烘干[10]。

莽草酸是小分子有机弱酸,易溶于水,在水中的溶解度为 180 g/L,难溶于三氯甲烷、苯和石油醚,并且水的成本较低,提取后无有害有机溶剂残留,经济环保,所以采用水作为提取溶剂。

3.2 样品中莽草酸提取工艺的优化

精确称取同一批马尾松样品干燥粉末2.5 g,对影响莽草酸提取效率的4个因素进行考察,设计4因素3水平的正交试验,即提取时间(1.5、2、2.5 h)、提取温度(75、85、95 ℃)、料液比(1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25)及原料粒度(40、60、80目)。试验结果表明:提取时间为2.5 h,提取温度为95 ℃,料液比为1 ∶ 20,粒度为60目,提取效率最高。

3.3 方法的确定与含量分析

采用HPLC法测定马尾松样品中莽草酸的含量,该方法准确性、精确度和重复性良好,适合测定松针及其他天然植物中莽草酸的含量。由结果分析可知,马尾松的成熟松针具有较高的开发价值,在不同树龄的马尾松中,数龄为10年的马尾松适合开发利用,可以在不破坏植被的情况下最大限度地利用自然资源。

3.4 研究意义

本课题研究对资源的开发和利用提供了研究方法和应用基础参考数据,对马尾松生态林的建设、资源开发、生态修复提供了科学依据,对资源利用的节约化和高效利用均具有重要的综合意义。对于松针中莽草酸的分离纯化、成品制取、提取后废料的资源再利用,本课题组正在进行进一步的深入研究。

参考文献:

[1]李 丹,彭少麟. 马尾松地理种源遗传变异规律研究的综述与分析[J]. 应用生态学报,2000,11(2):293-296.

[2]陈 英,刘成国,赵毓芝,等. 松针功能性成分及应用研究进展[J]. 安徽农业科学,2012,40(10):5994-5996.

[3]张 霞,孙爱东. 松针提取物的研究进展[J]. 中国食物与营养,2009(9):23-25.

[4]郑晓珂,王小兰,冯卫生. 松针提取物降血脂作用研究[J]. 中药药理与临床,2008,24(3):81-82.

[5]顾小文,朱开梅. 莽草酸及其衍生物医学作用的研究进展[J]. 医学综述,2013,19(6):1099-1101.

[6]Martin E,Duke J,Pelkki M,et al. Sweetgum (Liquidambar styraciflua L.): extraction of shikimic acid coupled to dilute acid pretreatment[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2010,162(6):1660-1668.

[7]Ghosh S,Chisti Y,Banerjee U C. Production of shikimic acid[J]. Biotechnology Advances,2012,30(6): 1425-1431.

[8]张中朋. 八角茴香、莽草酸生产市场概况[J]. 中国现代中药,2006,8(4):41-42.

[9]张军民,傅思武,石晓峰. 微生物代谢合成法在莽草酸及其衍生物研究中的应用[J]. 中国微生态学杂志,2013,25(1):91-93.

[10]张志琴,刘光明,杨永寿,等. 云南松松针中莽草酸的含量测定[J]. 云南民族大学学报:自然科学版,2012,21(1):10-12.endprint

2.4 稳定性试验

取松针供试液,在“1.3.3”节色谱条件下,于0、4、8、12、24 h分别测定莽草酸峰面积,分别为1 645 591、1 630 190、1 655 802、1 649 043、1 638 921,计算峰面积的RSD为0769%,表明样品供试液在24 h内稳定性良好。

2.5 加样回收试验

精确称取已知含量的马尾松松针粉末2.0 g,共5份,分别精确加入规定量的莽草酸标样,按样品供试液制备及测定法操作,分别进行色谱分析,其平均回收率为97.621%,RSD为0.949%,符合分析要求,结果见表1。

3 讨论与结论

3.1 样品的预处理以及提取溶剂的选择

据文献报道,莽草酸随着松针存放时间的延长而逐渐减少,可能是因为在莽草酸激酶的作用下,松针中的莽草酸经莽草酸途径代谢生成多种芳香族化合物,为了避免莽草酸的代谢转化,采集的马尾松松针样品应该及时烘干[10]。

莽草酸是小分子有机弱酸,易溶于水,在水中的溶解度为 180 g/L,难溶于三氯甲烷、苯和石油醚,并且水的成本较低,提取后无有害有机溶剂残留,经济环保,所以采用水作为提取溶剂。

3.2 样品中莽草酸提取工艺的优化

精确称取同一批马尾松样品干燥粉末2.5 g,对影响莽草酸提取效率的4个因素进行考察,设计4因素3水平的正交试验,即提取时间(1.5、2、2.5 h)、提取温度(75、85、95 ℃)、料液比(1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25)及原料粒度(40、60、80目)。试验结果表明:提取时间为2.5 h,提取温度为95 ℃,料液比为1 ∶ 20,粒度为60目,提取效率最高。

3.3 方法的确定与含量分析

采用HPLC法测定马尾松样品中莽草酸的含量,该方法准确性、精确度和重复性良好,适合测定松针及其他天然植物中莽草酸的含量。由结果分析可知,马尾松的成熟松针具有较高的开发价值,在不同树龄的马尾松中,数龄为10年的马尾松适合开发利用,可以在不破坏植被的情况下最大限度地利用自然资源。

3.4 研究意义

本课题研究对资源的开发和利用提供了研究方法和应用基础参考数据,对马尾松生态林的建设、资源开发、生态修复提供了科学依据,对资源利用的节约化和高效利用均具有重要的综合意义。对于松针中莽草酸的分离纯化、成品制取、提取后废料的资源再利用,本课题组正在进行进一步的深入研究。

参考文献:

[1]李 丹,彭少麟. 马尾松地理种源遗传变异规律研究的综述与分析[J]. 应用生态学报,2000,11(2):293-296.

[2]陈 英,刘成国,赵毓芝,等. 松针功能性成分及应用研究进展[J]. 安徽农业科学,2012,40(10):5994-5996.

[3]张 霞,孙爱东. 松针提取物的研究进展[J]. 中国食物与营养,2009(9):23-25.

[4]郑晓珂,王小兰,冯卫生. 松针提取物降血脂作用研究[J]. 中药药理与临床,2008,24(3):81-82.

[5]顾小文,朱开梅. 莽草酸及其衍生物医学作用的研究进展[J]. 医学综述,2013,19(6):1099-1101.

[6]Martin E,Duke J,Pelkki M,et al. Sweetgum (Liquidambar styraciflua L.): extraction of shikimic acid coupled to dilute acid pretreatment[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2010,162(6):1660-1668.

[7]Ghosh S,Chisti Y,Banerjee U C. Production of shikimic acid[J]. Biotechnology Advances,2012,30(6): 1425-1431.

[8]张中朋. 八角茴香、莽草酸生产市场概况[J]. 中国现代中药,2006,8(4):41-42.

[9]张军民,傅思武,石晓峰. 微生物代谢合成法在莽草酸及其衍生物研究中的应用[J]. 中国微生态学杂志,2013,25(1):91-93.

[10]张志琴,刘光明,杨永寿,等. 云南松松针中莽草酸的含量测定[J]. 云南民族大学学报:自然科学版,2012,21(1):10-12.endprint

猜你喜欢

高效液相色谱含量测定马尾松
马尾松栽培技术及抚育管理
空气中氧气含量测定实验的改进与拓展
高效液相色谱—串联质谱法测定槟榔中9种有机磷农药残留
高效液相色谱—二极管阵列检测器法测定胶囊壳中20种禁用工业染料
高效液相色谱概述及其在药品检验中的应用
马尾松果糖-1,6-二磷酸酶基因克隆及表达模式分析
马尾松初级种子园复壮技术
24年生马尾松种子园自由授粉子代测定及家系选择