王琳等

摘要：栽培双孢蘑菇必须通过覆土才能形成子实体，但是目前关于覆土刺激双孢蘑菇原基形成的机制还不是非常清楚。从覆土的物理性质、化学性质、微生物的作用3个方面阐述了覆土对双孢蘑菇子实体形成的作用，着重介绍了覆土层中微生物与双孢蘑菇子实体形成的关系、不同覆土材料的特性及其对双孢蘑菇产量的影响，以期对双孢蘑菇覆土机制的进一步研究提供参考。

关键词：双孢蘑菇；原基形成；覆土；机制

中图分类号： S359；S646.1+10.4 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0179-04

双孢蘑菇（Agaricus bisporus）别称白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇、西洋松茸，由于其栽培起源于300多年前的法国，因此又有“法国蘑菇”之称。双孢蘑菇是一种目前世界上栽培最广、规模最大、产量最多的全球性食用菌[1]，我国是双孢蘑菇的生产大国，出口量位居世界第一。覆土层是一种用来覆盖在培养料上的物质[2]，当双孢蘑菇的菌丝在培养料中生长并吃透料后，此时在料面上覆盖1层覆土，等菌丝长到覆土层后，降低温度、增加空气和覆土层的湿度，菌丝就开始扭结，形成子实体原基，原基不断生长就发育成可采收的蘑菇。双孢蘑菇子实体原基的形成过程有以下几个步骤：首先是许多菌丝相连并扭结在一起形成一条条菌索；然后在菌索特定部位的菌丝出现大量分支组成的菌丝团，这就是子实体原基；再由原基进一步分化发育成成熟的子实体[3]。如果不覆土，一般的双孢蘑菇就不能形成子实体原基。双孢蘑菇子实体的形成是非常复杂的生物学现象，至今还存在许多不清楚的地方，但是已经知道覆土在双孢蘑菇的栽培过程中起重要的作用，因为覆土提供的双孢蘑菇生长环境的变化使得双孢蘑菇由营养生长转向生殖生长[4]，同时覆土也是双孢蘑菇产量、质量和商业蘑菇均一性的主要影响因子[5]。尽管覆土的确切作用机理还不是很清楚，但人们普遍认为是覆土层特定的物理特性、化学性质和微生物的活动对双孢蘑菇子实体的形成起作用[6]。

1 覆土层的理化特性对子实体形成的影响

覆土层最重要的物理性质是能够提供双孢蘑菇菌丝生长和发育所需的水分，从而使其继续发展为子实体。其主要功能是防止料面干燥，为子实体提供支撑作用，也可以防止多次浇水对双孢蘑菇的结构造成破坏[7-8]。一般来说，双孢蘑菇子实体的含水量约为90%，因此尽量多提供可供利用的水分是增加产量的关键，而子实体中的水分主要来源于覆土材料和培养料，可见覆土是蘑菇生长发育所需水分的重要来源之一，此外高持水率也是优良覆土材料的重要特性之一。双孢蘑菇菌丝的延伸速度与覆土层的湿度是紧密相关的[9]，双孢蘑菇产量在第二潮时最大，而这时覆土层的基质势迅速下降。

覆土材料的透气性和吸附力对双孢蘑菇原基的形成也非常重要，李荣春用泥炭、树皮、椰子纤维、活性炭、无烟煤、褐煤、沸石和硅胶等8种材料进行覆土试验，结果表明，活性炭、椰子纤维、泥炭土上的双孢蘑菇子实体原基数量显著高于其他材料，且原基既能在有机材料上发生又能在无机材料上发生，与覆土材料的化学性质不相关，但在有机材料上比无机材料上能产生更多的原基[10]。无论使用无菌还是有菌的活性炭栽培双孢蘑菇，都能产生大量的原基，Long等也发现，以无菌活性炭为覆土材料，由于活性炭具有较高的吸附性能，因而能吸附某些抑制双孢蘑菇原基产生的物质（即结实基因表达），从而使原基发生[11]。在培养料中的双孢蘑菇菌丝生长时会产生一些挥发性的碳氢化合物，如氯甲烷、氧硫化碳、二硫化碳、乙烯等，其中乙烯被发现与子实体的形成有关，在原基向子实体发展的过程中，乙烯含量迅速增加[12]；此外一种挥发性的物质1-辛烯-3-醇会抑制原基进一步形成[13]。还有一种理论是在对覆土进行热处理时，活性炭会影响覆土层水分中CO2的反应[14]，由于活性炭能吸收CO2[15]，因此在覆土层和培养料层之间会产生CO2梯度，而CO2浓度降低会诱导双孢蘑菇原基的形成。Tschierpe等观察到线状的蘑菇菌丝只要在低浓度的CO2中就可以产生子实体[16]。在没有灭菌的覆土里，CO2参与蘑菇的代谢活动，并与覆土层中的水分反应而转化成碳酸，接着与碳酸钙反应并释放出Ca2+和HCO3-，因此认为直接影响蘑菇菌丝生长方式的不是CO2，而是其水解产物——HCO3-。Masaphy等研究发现，蘑菇在营养生长时，其菌丝表面附有草酸钙结晶，而在覆土层中原基形成前的菌丝表面没有发现草酸钙结晶[17]。在热处理草炭和碳酸钙时，碳酸氢盐-二氧化碳缓冲发生还原反应可引起与草酸反应的钙减少[14，18]，覆土层中以还原态存在的铁会抑制蘑菇的生长，而草酸是铁的络合物，活性炭则能够吸收Fe2+的螯合物[14，19]。

此外，保持覆土层中较低的营养水平和较低的盐离子浓度有利于保持水分，从而促进双孢蘑菇原基的形成；覆土层中盐浓度过高则会抑制双孢蘑菇原基的形成[7，18]。Gülser等使用4种不同的材料进行覆土，发现覆土中盐浓度和双孢蘑菇的产量呈负相关，覆土中较低的盐浓度能够显著增加双孢蘑菇的产量[4]；还有研究发现，覆土层中铁的浓度与蘑菇产量呈正相关，而高浓度的钾、镁能抑制双孢蘑菇子实体的形成[3]。此外，优良覆土层的pH值应呈中性或微碱性，具有碳酸钙缓冲、高阳离子交换能力，同时含有镁含量低、毒性低的物质，这些均有利于双孢蘑菇原基的形成并转化成子实体。覆土中总氮浓度应保持在0.7%～0.8%[3]。原基的形成还与双孢蘑菇自身的遗传特性有关，有研究表明，对6个品种的双孢蘑菇分别使用灭菌和不灭菌的覆土材料，所有品种在不灭菌的覆土条件下都能产生数量不同的原基，只有B430品种能够在无菌的覆土条件下长出少量原基，其他的品种都不能在无菌条件下产生原基[20]。

2 覆土层的微生物作用

土壤微生物能够参与许多生态系统中的各种生化过程，其中包括能量和营养物质循环及各类有机质的转化。关于覆土层中微生物对双孢蘑菇子实体形成的作用存在争议，最初对蘑菇覆土层中的微生物作用进行研究发现，微生物对蘑菇子实体的生长无关，因为在覆土灭菌进行出菇试验中，有的也有子实体原基发生。说明灭菌覆土是由于经高压灭菌后产生了抑制出菇的物质，并不是因为没有微生物才导致长不出菇的[20]。在研究双孢蘑菇原基发生时发现，在不同的蘑菇品种和不同的培养基条件下，原基的发生数量都不同。有研究认为，蘑菇原基的形成依赖于培养基的种类、碳源、CO2等环境条件，而不受臭味假单孢菌或其他细菌悬浮液或过滤液的影响[21]。与此同时，Eger提出不同的观点，他最早提出蘑菇从营养生长向生殖生长转化的关键取决于覆土层微生物的活动[22]，而后有关这方面的文献报告也日益增多。许多支持此观点的学者认为，蘑菇子实体原基的形成除与覆土层的理化性质有关外，还和微生物密切相关。覆土层中微生物数量和组成的变化与蘑菇生长特性，如原基发生早晚、发生量、子实体数量及产量等密切相关[23]。Hayes等在琼脂培养基上用从商业栽培的覆土层中分离出的臭味假单孢菌（Pseudomonas putida）诱导出了蘑菇子实体原基，并在琼脂培养基上研究臭味假单孢菌对绒状和索状蘑菇菌丝的影响时发现，假单孢杆菌是蘑菇子实体发生所必需的[24-25]。由此可以认为，臭味假单孢杆菌在蘑菇子实体发生中起重要作用[26]。

在对覆土层可培养的细菌群落磷脂脂肪酸PLFA分析发现，土壤中的细菌总数在第一潮菇原基形成时相对较高，且在蘑菇的生长过程中细菌总数有明显增加；双孢蘑菇的生长会影响覆土层中的细菌群落，覆土会导致革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌之间的比例增加，说明革兰氏阴性细菌对双孢蘑菇原基的形成起重要作用[6]。通过变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）分析双孢蘑菇的覆土时期、原基形成和收获时的覆土层中微生物的多样性时发现，覆土层中的细菌在原基形成时和收获时的多样性大于刚覆土时的，原基形成时细菌的种群主要为假单胞菌、黄杆菌属，αβγδ-节杆菌和一些不可培养的种属[27]。

3 微生物促进双孢蘑菇子实体形成的机理

有学者认为，双孢蘑菇在菌丝生长过程中会分泌一种自我抑制剂，这种抑制剂能够被细菌分解利用从而使其降低到一定的水平，即解除抑制，从而允许双孢蘑菇原基的形成[11，21]，Hayes等认为这与覆土层的铁离子浓度有关，即微生物（主要是臭味假单孢杆菌）通过溶解覆土层中的铁，把Fe3+还原成Fe2+，在提高铁的有效性和利用率的同时刺激蘑菇原基的形成[24]。Eger在研究覆土层微生物对原基的发生和作用时发现，未灭菌的覆土材料放在培养料旁也产生了原基，他认为是覆土微生物的代谢产物诱导了蘑菇原基的发生[22]。Park等认为，细菌的代谢产物对蘑菇子实体的发生起重要作用[28]。日本的Urayama报道并分离出一种能诱导蘑菇原基发生的杆状细菌代谢产物[29]。张大飞等认为，双孢蘑菇子实体原基的形成及发育过程对乙烯敏感，高浓度的乙烯对其有抑制作用[30]。双孢蘑菇能够合成1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminoeyelopropane-1-carboxylic acid，ACC）并转化ACC而生成乙烯。覆土的作用是使培养料中菌丝产生的ACC通过毛细管作用或扩散作用及时转移到覆土中而被其中的细菌利用，从而降低菌丝产生乙烯的量，解除乙烯对子实体原基形成和发育的抑制作用。已有很多研究证实，恶臭假单胞菌是一种生防细菌，它不但能够产生嗜铁素，而且能够产生吲哚乙酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶，同时具有一定的溶磷能力[31-32]。假单胞菌是活跃在植物根际的一大类根际促生微生物（plant growth promoting rhizobacteria，PGRA），能够调节植物的微生态环境，从而对宿主植物起防病促生的作用。假单胞菌对于宿主食用菌也有类似的防病促生作用。细菌和真菌之间的相互作用是最近研究的热点，如侧耳属（Pleurotus spp.）真菌和固氮细菌之间的联合固氮[33-34]、橄榄绿链霉菌（Streptomyces olivaceoviridis）和多育曲霉（Aspergillus proliferans）协同利用大分子物质几丁质[35]。Chen等研究发现，覆土中20%可培养的细菌都能产生ACC脱氨酶，将筛选出来的能产生ACC脱氨酶的臭味假单孢菌UW4与双孢蘑菇进行共培养，发现它们能够附着在双孢蘑菇的菌丝上并刺激双孢蘑菇菌丝产生，抑制双孢蘑菇产生乙烯，从而减轻乙烯对原基形成的抑制[36]。

由以上研究可以看出，覆土微生物本身的代谢产物及其引起的覆土层化学环境的变化是诱导蘑菇子实体发生的重要原因之一。

4 覆土材料的选择

国内外的研究结果表明，目前最理想的覆土材料是泥炭土，其最大持水量可达90%（普通泥土仅为20%～30%）；泥炭土的团粒结构好，疏松透气，不会板结；在幼菇生长发育过程中所需喷水次数少，菇质好。因此，泥炭土目前在西方发达国家工厂化栽培中的应用极为普遍。尽管泥炭土已经被广泛应用于覆土，但是它也是一种不可再生资源，由于每年双孢蘑菇工厂化生产都会消耗掉大量的泥炭土，因而选择一种替代材料作为覆土对于减少自然资源消耗、保护环境具有重要意义。此外，还有一些材料如泥土、蛭石、发酵过的蘑菇菌糠等也可以作为覆土材料。Gülser等用泥炭和制茶废料等比例混合后作为覆土材料发现，与单纯泥炭相比，其双孢蘑菇的产量没有显著差异[4]。有研究发现，覆土层中高浓度的可溶性盐、有机物、无机物都会导致双孢蘑菇减产，而较高浓度的铁会提高双孢蘑菇的产量[3]。使用EDTA处理菌糠能够螯合其中的金属离子，从而降低菌糠中的金属离子含量，将处理过的菌糠消毒后与泥炭土混合作为覆土，双孢蘑菇的干物质含量显著高于以纯泥炭土为覆土的对照组[37]。在我国，泥炭土主产于东北原始森林，从采购、运输到制作，价格昂贵，因此在我国目前条件下，如何利用当地现有资源，用工农业废弃物仿制泥炭土以达到提高双孢蘑菇产量和质量的目的，成为栽培手段改良的新趋势，如果能够找到价格低廉、制作方便的仿制泥炭土的方法，将具有很大的应用推广价值。王志强等研究发现，在泥土中掺入80%无氧发酵的废菌糠可以提高覆土的保水性，且产量仅次于使用泥炭土作为覆土的试验组，大大降低了覆土的成本[38]。国内在生产上为了降低成本主要还是使用砻糠河泥、河塘土、塘泥黄土作为覆土材料[30，39-40]。将泥炭和其他材料按一定比例进行混合，尽管在产量上与纯泥炭没有显著差异，但是能够显著提高投入产出比。马晓龙等研究发现，使用50%泥炭-谷壳塘泥复合土配方能获得较好的经济效益，覆土经济投入为5.54元/m2，产出为17.85元/m2；而如果使用纯泥炭土，覆土的经济投入则为8元/m2，产出为18.45元/m2[41]。将泥炭土和茶叶生产废料按1 ∶ 1混合作为覆土材料，发现双孢蘑菇的产量与用纯泥炭土相比没有显著变化。

5 结论

覆土在双孢蘑菇的栽培中起重要的作用，可以使双孢蘑菇的生长环境发生变化从而使其从营养生长向生殖生长转化。覆土的物理化学性质如透气性、持水率、吸附性、盐分、低渗透压和pH值都会影响双孢蘑菇菌丝的生长，覆土层的低营养水平及足够的低盐浓度能够减少水分的缺失而保证原基形成需要的水分。覆土中微生物对双孢蘑菇原基形成的作用也非常明显，主要通过假单胞菌属的细菌产生一些代谢物质与双孢蘑菇的之间相互作用而刺激双孢蘑菇原基的形成。可以看出，大量研究工作表明覆土对蘑菇子实体形成的作用及作用机理较为复杂，包含覆土的物理化学特性及微生物的作用等多个方面。通过对覆土作用机理的探讨，有利于建立一个标准的模式来预测双孢蘑菇的生长行为，并且可以从改善覆土的理化特性、微生物区系来优化双孢蘑菇的生长条件，从而提高双孢蘑菇的产量和质量。

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