陈剑等

摘要：为探索畜禽产品中雌激素残留的检验方法，加强对畜禽生产过程中激素添加的监控，本研究选择了在我国几种常见影响比较大的合成雌激素-β-雌二醇（E2）为研究对象，建立用于测定动物尿液中雌激素的重组基因酵母检测法。结果表明本方法简单、有效，能够作为雌激素残留检测体系的有益补充。

关键词：畜禽产品；重组雌激素受体基因酵母细胞；牛尿液；雌激素；β-雌二醇；残留检测

中图分类号： S852.23 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0166-02

生产中广泛应用的雌激素，可以通过食物链富集作用于人体，导致生殖障碍、出生缺陷、发育异常、代谢紊乱以及某些癌症的发生[1]。世界很多国家计划或已经制定了一些法律法规限制此外类物质的使用，譬如除己烯雌酚等人工合成类雌激素化合物于1980年华沙国际学术讨论会和同年的联合国粮农组织与世界卫生组织联席会议决定全面禁用[2]。就目前而言，对于环境雌激素的研究还处于起步阶段，很多问题有待进一步揭示。随着重组DNA技术、基因表达及酵母分子遗传学研究的进展，越来越多的外源基因在酵母细胞中获得高效表达，因此，酵母作为一个基因工程表达系统受到广泛研究应用[3]。通过本研究希望能够为我国建立快速检测牛生产中添加雌激素情况的监测提供新技术支持、构建我国畜禽安全生产的预警体系。

1 测定原理

将人类雌激素受体基因（hER cDNA）转化于酵母，使其高效表达，再将雌激素反应原件（ERE）与编码β-半乳糖苷酶的LacZ报告基因相串联，重组于酵母细胞。当牛尿中的雌激素活性物质与酵母中的hER结合后，会通过生物变构效应，经雌激素效应元件（ERE）顺式激活Lac Z （β-半乳糖苷酶） 基因表达，从而使Lac Z的表达量增加。通过测定Lac Z的活性就可以定量反映牛尿中雌激素的含量。

2 试验材料

2.1 试验样品采集

小牛尿液：从扬州大学实验农牧场采集出生10日龄的小牛尿液12份，依次编号分别为112、113、116、117、119、120、121、122、123、124、125、128。

2.2 试验材料

C18柱（美国Welch公司）；甲醇（上海振兴化工一厂，分析纯）；丙酮、无水乙醇、浓盐酸氢氧化钠、二氯甲烷（上海焱晨化工实业有限公司，均为分析纯）；琼脂粉（中国医药集团上海化学试剂公司）；酵母基本合成配养基（SD）及无色氨酸、尿嘧啶（-Trp、-Ura）营养补料原料（美国Clontech公司）；β-雌二醇（扬州大学医学院李湘鸣教授提供）。

3 试验过程

3.1 重组雌激素受体基因细胞酵母培养

3.1.1 培养板制作 按照配方配制选择性固体培养平板SD/-trp、-ura （无色氨酸、尿嘧啶），经121 ℃灭菌20 min，取约15 mL倒入消毒培养皿中，冷凝后用保鲜膜密封，4 ℃保存备用。

3.1.2 重组雌激素受体基因酵母细胞（W303-1A/hER-ERE-LacZ）接种 在无菌操作台内将W303-1A/hER-ERE-LacZ划线接种于SD/-trp、-ura 平板，置于30 ℃培养箱内培养3～4 d，使其长出3～4 mm的酵母克隆，保鲜膜密封，4 ℃冰箱保存。

3.1.3 扩增酵母克隆 取消毒玻璃瓶1只，加入3 mL SD/-trp、-ura 培养液，用接种环从SD/-trp、-ura 培养板挑取酵母克隆置于3 mL SD/-trp、-ura 培养液中，在30 ℃恒温振荡器中培养过夜（约14 h）。

3.2 样品预处理

用定性滤纸和漏斗将原尿过滤至干净消毒玻璃瓶中。为减少误差，用具塞试管分装过滤牛尿至消毒玻璃瓶中，每样2份，一份取5 mL做加样试验，另一份取5 mL做空白对照。

3.3 试剂配制

（1） 8 mol/L NaOH （分子量40）：称取NaOH 32 g，用 100 mL 双蒸水充分溶解。（2） 0.1 mg/mL溶菌酶的ONPG：取40 mg ONPG粉末，加入10 mL的Z Buffer，再加入溶菌酶使其终浓度为 0.1 mg/mL，避光充分混匀，分装为2 mL/管，冷冻保存。

3.4 尿样加标

小牛尿液分别加入试验选择的雌激素物质：乙炔雌二醇。β-雌二醇做加标后在小牛尿液中的终浓度达到0.050 mol/L。空白对照（即尿样空白）加入等量的乙醇；试剂空白用2 mL蒸馏水代替小牛尿液。

3.5 C18吸附柱活化

用移液器吸取2.5 mL甲醇淋洗C18吸附柱，每次 15 min，共3次，再用双蒸水清洗3次，每次15 min，将活化后的吸附柱放入4 ℃冰箱保存备用。

3.6 水解

目的是将内源性的结合性雌激素类化合物水解为游离型。分别取加标尿液2 mL置于具塞试管中，依次加入2 mL HCl、2 mL甲醇；空白对照和试剂空白与尿样完全相同。

将试管于100 ℃水浴作用1 h，然后吸取2 mL用 8 mol/L NaOH调节溶液pH值至3.0。

3.7 吸附

将上述pH值为3.0水解液分别通过活化C18吸附柱，弃去流出液。在无液体流出后（吸附约20 min），用循环水式真空泵抽气5 min，尽量除去C18吸附柱中残留的水分。然后用4 mL二氯甲烷洗脱C18吸附柱2次，每次约30 min。将洗脱液洗置于消毒玻璃瓶中，封口编号。

4 雌激素类化学物测定

4.1 作用于酵母细胞

在无菌操作台内，将每份试验尿样用二氯甲烷洗脱液吸取0.1 mL至消毒玻璃瓶中，置于37 ℃烘箱内，挥发5 min。加入1.5 mL SD/-trp、-ura 培养液，再加入0.5 mL过夜酵母培养液，使其在培养液中浓度分别为100、0 mg/mL（对照），30 ℃继续振荡培养6 h。

4.2 显色

取透明酶标板，每3孔分为1组。加入20 μL受试物作用的酵母细胞培养液，然后加入40 μL含0.1 mg/mL溶菌酶的ONPG，最后加入160 μL含1%SDS Z Buffer，在37 ℃振荡箱内显色，记录受试样品的显色时间，最后用50 μL 1 mol/L的NaCO3 中止其反应。同时以同样的方法取透明酶标板，加入0.1 mL于30 ℃作用6 h的酵母培养液，用于测波长为 630 nm 处的细胞密度。

4.3 测光密度

用酶标仪测光密度，于波长为405 nm处测显色尿样，波长为630 nm处测经受试物作用的酵母细胞培养液的细胞密度，求D405 nm/D630 nm之比值。

5 结果与分析

5.1 重组基因酵母细胞对β-雌二醇的反应

表1为重组基因酵母细胞对加入β-雌二醇和小牛原尿的反应变化，以D405 nm/D630 nm之比值表示。由表1可以看出，重组基因酵母细胞对100 ng/mL浓度的β-雌二醇可以产生明显的响应，12份加入β-雌二醇小牛尿的D405 nm/D630 nm最高值达1.624，最低值为0.679；而小牛原尿D405 nm/D630 nm普遍较低，最高值为1.394，最低值为0.393，经配对t检验表明2组差异极显著（t=3.722，P=0.003 3）。空白试剂中雌激素活性更低，说明小牛原尿中仅含极微量的雌激素。

5.2 重组基因酵母细胞对β-雌二醇的反应分析

根据试验所得数据和研究分析，重组基因酵母细胞对加入β-雌二醇的小牛原尿的反应明显，所有加标尿样中的雌激素水平很高，均高于不加标样，说明刚出生的小牛性器官还处于原始状态，雌激素分泌极少。小牛原尿和空白试剂（蒸馏水）反应差别不大，但稍高于空白试剂，说明小牛原尿中含极微量的雌激素，可能是小牛摄入母乳所致。因为小牛毕竟是生物活体，所产生的体液中还具有其他的生物活性物质，因此与空白试剂相比，所测结果也可能是其他生物活性物质的干扰性反应。通过比较分析，小牛原尿组成的雌激素类化合物和蒸馏水无明显差别。

这次检测的尿液样本的过程相对简单，利用酵母检测雌激素生物活性方法灵敏、快速、方便。不过该验证方法只是定性筛选方法，所以如果筛选出可疑样品需要做进一步证实。选择10日龄小牛尿作为试验对象是真实物质载体，可以更好地说明酵母细胞检测方法准确方便的优异性。

5.3 问题与展望

雌激素的种类繁多，广泛存在于生活和生产环境中，对人体可产生多方面的作用。随着工业的发展，雌激素的污染进一步加重，威胁着人类的健康、生存与繁衍。而随着污染的日益严重，将会有越来越多的物质被怀疑具有雌激素效应。但是就目前而言，对于环境雌激素的研究还处于起步阶段，其种类还在增加，很多问题有待进一步揭示。因此，建立快速经济、简单有效的生物检测方法就显得尤为重要。发展出快速、简便的方法是国内外许多专家、学者致力的研究目标，并且已经取得了一些进步，但有效监控雌激素还需广大科技工作者做出更多的努力。

参考文献：

[1]王一梅，王 洋，唐 非. 环境雌激素的研究现状（二）——环境雌激素的测定[J]. 公共卫生与预防医学，2009（2）：47-49.

[2]郁 倩. 动物性食品和水中雌激素残留污染检测的研究[D]. 无锡：江南大学，2008.

[3]李湘鸣， 罗方妮， 刘桂霞，等.基因重组酵母细胞检测养殖场污水中环境雌激素[J]. 农业环境科学学报，2007，26（6）：2200-2205.

4.2 显色

取透明酶标板，每3孔分为1组。加入20 μL受试物作用的酵母细胞培养液，然后加入40 μL含0.1 mg/mL溶菌酶的ONPG，最后加入160 μL含1%SDS Z Buffer，在37 ℃振荡箱内显色，记录受试样品的显色时间，最后用50 μL 1 mol/L的NaCO3 中止其反应。同时以同样的方法取透明酶标板，加入0.1 mL于30 ℃作用6 h的酵母培养液，用于测波长为 630 nm 处的细胞密度。

4.3 测光密度

用酶标仪测光密度，于波长为405 nm处测显色尿样，波长为630 nm处测经受试物作用的酵母细胞培养液的细胞密度，求D405 nm/D630 nm之比值。

5 结果与分析

5.1 重组基因酵母细胞对β-雌二醇的反应

表1为重组基因酵母细胞对加入β-雌二醇和小牛原尿的反应变化，以D405 nm/D630 nm之比值表示。由表1可以看出，重组基因酵母细胞对100 ng/mL浓度的β-雌二醇可以产生明显的响应，12份加入β-雌二醇小牛尿的D405 nm/D630 nm最高值达1.624，最低值为0.679；而小牛原尿D405 nm/D630 nm普遍较低，最高值为1.394，最低值为0.393，经配对t检验表明2组差异极显著（t=3.722，P=0.003 3）。空白试剂中雌激素活性更低，说明小牛原尿中仅含极微量的雌激素。

5.2 重组基因酵母细胞对β-雌二醇的反应分析

根据试验所得数据和研究分析，重组基因酵母细胞对加入β-雌二醇的小牛原尿的反应明显，所有加标尿样中的雌激素水平很高，均高于不加标样，说明刚出生的小牛性器官还处于原始状态，雌激素分泌极少。小牛原尿和空白试剂（蒸馏水）反应差别不大，但稍高于空白试剂，说明小牛原尿中含极微量的雌激素，可能是小牛摄入母乳所致。因为小牛毕竟是生物活体，所产生的体液中还具有其他的生物活性物质，因此与空白试剂相比，所测结果也可能是其他生物活性物质的干扰性反应。通过比较分析，小牛原尿组成的雌激素类化合物和蒸馏水无明显差别。

这次检测的尿液样本的过程相对简单，利用酵母检测雌激素生物活性方法灵敏、快速、方便。不过该验证方法只是定性筛选方法，所以如果筛选出可疑样品需要做进一步证实。选择10日龄小牛尿作为试验对象是真实物质载体，可以更好地说明酵母细胞检测方法准确方便的优异性。

5.3 问题与展望

雌激素的种类繁多，广泛存在于生活和生产环境中，对人体可产生多方面的作用。随着工业的发展，雌激素的污染进一步加重，威胁着人类的健康、生存与繁衍。而随着污染的日益严重，将会有越来越多的物质被怀疑具有雌激素效应。但是就目前而言，对于环境雌激素的研究还处于起步阶段，其种类还在增加，很多问题有待进一步揭示。因此，建立快速经济、简单有效的生物检测方法就显得尤为重要。发展出快速、简便的方法是国内外许多专家、学者致力的研究目标，并且已经取得了一些进步，但有效监控雌激素还需广大科技工作者做出更多的努力。

参考文献：

[1]王一梅，王 洋，唐 非. 环境雌激素的研究现状（二）——环境雌激素的测定[J]. 公共卫生与预防医学，2009（2）：47-49.

[2]郁 倩. 动物性食品和水中雌激素残留污染检测的研究[D]. 无锡：江南大学，2008.

[3]李湘鸣， 罗方妮， 刘桂霞，等.基因重组酵母细胞检测养殖场污水中环境雌激素[J]. 农业环境科学学报，2007，26（6）：2200-2205.

4.2 显色

取透明酶标板，每3孔分为1组。加入20 μL受试物作用的酵母细胞培养液，然后加入40 μL含0.1 mg/mL溶菌酶的ONPG，最后加入160 μL含1%SDS Z Buffer，在37 ℃振荡箱内显色，记录受试样品的显色时间，最后用50 μL 1 mol/L的NaCO3 中止其反应。同时以同样的方法取透明酶标板，加入0.1 mL于30 ℃作用6 h的酵母培养液，用于测波长为 630 nm 处的细胞密度。

4.3 测光密度

用酶标仪测光密度，于波长为405 nm处测显色尿样，波长为630 nm处测经受试物作用的酵母细胞培养液的细胞密度，求D405 nm/D630 nm之比值。

5 结果与分析

5.1 重组基因酵母细胞对β-雌二醇的反应

表1为重组基因酵母细胞对加入β-雌二醇和小牛原尿的反应变化，以D405 nm/D630 nm之比值表示。由表1可以看出，重组基因酵母细胞对100 ng/mL浓度的β-雌二醇可以产生明显的响应，12份加入β-雌二醇小牛尿的D405 nm/D630 nm最高值达1.624，最低值为0.679；而小牛原尿D405 nm/D630 nm普遍较低，最高值为1.394，最低值为0.393，经配对t检验表明2组差异极显著（t=3.722，P=0.003 3）。空白试剂中雌激素活性更低，说明小牛原尿中仅含极微量的雌激素。

5.2 重组基因酵母细胞对β-雌二醇的反应分析

根据试验所得数据和研究分析，重组基因酵母细胞对加入β-雌二醇的小牛原尿的反应明显，所有加标尿样中的雌激素水平很高，均高于不加标样，说明刚出生的小牛性器官还处于原始状态，雌激素分泌极少。小牛原尿和空白试剂（蒸馏水）反应差别不大，但稍高于空白试剂，说明小牛原尿中含极微量的雌激素，可能是小牛摄入母乳所致。因为小牛毕竟是生物活体，所产生的体液中还具有其他的生物活性物质，因此与空白试剂相比，所测结果也可能是其他生物活性物质的干扰性反应。通过比较分析，小牛原尿组成的雌激素类化合物和蒸馏水无明显差别。

这次检测的尿液样本的过程相对简单，利用酵母检测雌激素生物活性方法灵敏、快速、方便。不过该验证方法只是定性筛选方法，所以如果筛选出可疑样品需要做进一步证实。选择10日龄小牛尿作为试验对象是真实物质载体，可以更好地说明酵母细胞检测方法准确方便的优异性。

5.3 问题与展望

雌激素的种类繁多，广泛存在于生活和生产环境中，对人体可产生多方面的作用。随着工业的发展，雌激素的污染进一步加重，威胁着人类的健康、生存与繁衍。而随着污染的日益严重，将会有越来越多的物质被怀疑具有雌激素效应。但是就目前而言，对于环境雌激素的研究还处于起步阶段，其种类还在增加，很多问题有待进一步揭示。因此，建立快速经济、简单有效的生物检测方法就显得尤为重要。发展出快速、简便的方法是国内外许多专家、学者致力的研究目标，并且已经取得了一些进步，但有效监控雌激素还需广大科技工作者做出更多的努力。

参考文献：

[1]王一梅，王 洋，唐 非. 环境雌激素的研究现状（二）——环境雌激素的测定[J]. 公共卫生与预防医学，2009（2）：47-49.

[2]郁 倩. 动物性食品和水中雌激素残留污染检测的研究[D]. 无锡：江南大学，2008.

[3]李湘鸣， 罗方妮， 刘桂霞，等.基因重组酵母细胞检测养殖场污水中环境雌激素[J]. 农业环境科学学报，2007，26（6）：2200-2205.