吴双等

摘要：为开展新城疫病毒（NDV）LaSota疫苗株的反向遗传操作技术研究，了解该病毒的准种分化情况，运用鸡胚极限稀释法对NDV LaSota疫苗株进行传代纯化，选择病毒稀释度最高、血凝价较高的鸡胚尿囊液作为传代接种物，传至第5代，RT-PCR扩增序列，测定并分析其全基因组序列，阐述LaSota疫苗株准种分化情况，为基因工程疫苗的研制奠定了一定基础。

关键词：新城疫病毒；LaSota疫苗株；准种；极限稀释法

中图分类号： S852.65+7 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0161-03

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）强毒株引起的一种禽类致死性传染病，是当今世界上危害最大的家禽传染病之一[1-4]，被国际兽疫局（OIE）列为必须呈报的疫病之一。该病最常侵袭鸡和火鸡，至少250种鸟类可自然或实验室感染NDV，且强毒感染能对其造成100%的死亡率[5]。NDV属于副黏病毒科，禽腮腺炎病毒属，其基因组由单股负链RNA构成，基因组结构为 3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）和大分子蛋白（L），其中病毒囊膜表面的2种糖蛋白F和HN是构成NDV致病性的主要分子基础[6]。对于ND疾病的控制，在发达国家以捕杀强毒感染群为主，同时结合疫苗接种，而在广大发展中国家疫苗接种仍是控制该病的主要手段。NDV经典弱毒疫苗毒株LaSota具有抗体提升快、繁殖性能良好、免疫原性好、抗体效价高、遗传稳定性好等优势，被世界各国广泛应用于雏鸡免疫。然而，在长达近百年的使用过程中，LaSota毒种被反复鸡胚传代，准种分化严重。准种是由Eigen在1971年提出的用于描述同种生物遗传异质性的概念[7]，感染个体内同种病毒的遗传异质性是RNA病毒具有的一种普遍的生物学特性，实际上是由一系列基因序列相近而又不完全相同的突变体构成的。准种是病毒基因组突变或重组的结果，是连续的遗传变异、竞争和选择所产生的[8]。

本研究使用SPF鸡胚极限稀释法对笔者所在实验室保存的NDV LaSota病毒株进行纯化，测定其全基因组序列，以揭示该毒株的准种遗传变异，这对后续开展该毒株的反向遗传学研究具有重要意义，也为基因疫苗的研制奠定了一定的基础。

1 材料与方法

1.1 病毒和鸡胚

LaSota株和NDV阳性血清购自中国兽医药品监察所，由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室保存。SPF种蛋购自山东家禽研究所SPF鸡场，由本室孵化至所需日龄。

1.2 常用分子生物学试剂和分子生物学软件

Trizol抽提试剂购自Invitrogen公司；DNA凝胶回收试剂盒、大肠杆菌（Escherichia coli）菌种DH5α感受态细胞、质粒小提试剂盒购自天根生物有限公司；X-Gal、IPTG、dNTPs、6 nt 随机引物等购自宝生物工程（大连）有限公司；高保真聚合酶2×LAmp MasterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司；EcoRⅠ、DNA Markers购自Fermentas生物工程有限公司；禽白血病反转录酶、RNA 酶抑制剂、pGEM-T easy 载体vector和琼脂糖购自Promega公司；焦碳酸二乙酯购自AMRESCO公司；蛋白栋和酵母提取物购自英国OXOID公司；饱和酚、三氯甲烷、异丙醇等常规试剂购自生工生物有限公司；其余试剂均为国内分析纯；磷酸盐缓冲液（PBS）、1%鸡红细胞按OIE标准方法自制。Primer Premier 5.0和DNAStar 4.0版本软件包中的分析软件有DNASTAR Inc. Madison、WI153715，USA。

1.3 NDV LaSota株复壮和增殖

取-80 ℃保存的LaSota种毒，室温融化，用无菌PBS进行10-6稀释，按0.2 mL/胚接种到9～11日龄SPF鸡胚上，37 ℃ 孵育，每12 h观察1次，观察120 h。弃去24 h内死亡的鸡胚，将24 h以后死亡及120 h以后未死亡的鸡胚置于 4 ℃ 冰箱中过夜，收集尿囊液，单胚单收，逐个测定每胚尿囊液的血凝价（HA效价），从所收获的尿囊液中挑选HA效价高的尿囊液，保存于-80 ℃冰箱。HA试验按OIE 标定的β微量法进行。

1.4 NDV LaSota株纯化和筛选

毒种纯化采用鸡胚极限稀释法，将HA效价高的尿囊液作10倍系列稀释至10-10，然后取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10等5个连续稀释度的尿囊液，按0.1 mL/胚接种到9～11日龄SPF鸡胚上，每个稀释度接种鸡胚5枚，接种后置于 37 ℃ 温箱孵育，逐个收获24～120 h死亡鸡胚及120 h 后存活鸡胚的尿囊液，无菌操作，单胚单收，分别测定每个鸡胚尿囊液的血凝价。同时，根据Reed-Muench法计算鸡胚半数感染量（EID50）。选择病毒稀释度最高、血凝价 HA 较高的鸡胚尿囊液作为传代接种物，按上述方法进行，继续病毒接种传代。

1.5 引物设计与合成

参考GenBank中NDV LaSota的全基因组序列，利用Premier 5.0设计10对引物，相邻扩增片段之间有50～200 nt核酸序列相互重叠，拼接起来可以覆盖NDV全基因组。引物序列见表1，引物均由上海Invitrogen公司合成。

测序比对结果表明，纯化株与原病毒株在基因序列上并没有太大差异，HN蛋白氨基酸突变率最高，为0.29%，M蛋白和F蛋白没有突变，说明该纯化株仍为LaSota病毒株，没有在筛选传代的过程中发生根本变异。

将此纯化株分别与GenBank上的LaSota（登录号分别为AF077761.1、AY845400.2和JF950510.1）全基因组序列相比，核苷酸的同源性分别为99.2%、99.0%和99.6%，突变主要集中在L和HN蛋白上。3 结论与讨论

准种是同一株病毒在宿主体内表现为一群系统发育密切相关的变异株，它是由一定数量核苷酸相同的优势准种和序列互不相同的劣势准种组成的。RNA依赖的RNA聚合酶因缺乏3′→5′核酸外切酶活性而使复制中产生的错误未能校正、宿主本身的选择（正选择作用）和病毒基因组结构的限制（负选择作用）3种机制会导致优势准种不固定，在一些外界选择压力作用下，劣势准种甚至可替代优势准种。

为了更好地开展该毒株的反向遗传操作技术研究，在病毒纯化过程中，有必要进行几个病毒克隆株的筛选，以获得一株能代表绝大多数病毒克隆株性质的克隆株。首先，在病毒传代过程中考虑到疫苗制备需要，每次应选择病毒稀释度最高、血凝价较高的尿囊液作为传代接种物；其次，扩增基因片段时选择高保真聚合酶，PCR循环数设为25次；最后，为避免PCR 过程可能造成基因的变异以及测序过程中可能带来的突变，对该病毒基因片段至少测序5个阳性克隆，综合多次测序结果获得其全长基因序列，因此所获得的序列应该能够真实反映该病毒株基因组的核苷酸序列。

纯化株序列与种毒株序列以及GenBank 中的3株 LaSota 株序列相比较，结果发现核苷酸发生变异，表明该疫苗株是在自然界的选择压力与免疫压力下对外界环境变化而发生的一种适应性突变。NDV囊膜表面的F和HN等2个糖蛋白容易经受选择压力的作用，同时也是构成NDV主要致病性的分子基础[10]。Peeters 等在1999年发现尤其是F蛋白在NDV致病过程中发挥着重要作用[2]。然而，巩艳艳等在2009年抗体免疫选择压可显著影响HN基因变异，且其受影响程度高于F基因，认为HN基因的变异更能代表NDV 的进化规律和趋势[11]。笔者发现F蛋白没有发生突变，而HN蛋白的突变率最高，碱基突变率达到了0.29%，与巩艳艳等的研究结果[11]一致。本研究结果在一定程度上也表明NDV的进化是多个基因包括调控区共同演化的结果。

参考文献：

[1]于 洋，封振，何孔旺，等. 新城疫病毒毒力分子机制研究进展[J]. 江苏农业学报，2013，29（2）：435-439.

[2]梁淑珍，郭 兵，王海风. 中药复方对鸡新城疫疫苗免疫效果的影响[J]. 江苏农业科学，2012，40（2）：176-178.

[3]段志强，胡 娇，胡增垒，等. 鹅源新城疫病毒M基因的原核表达及其多克隆抗体制备[J]. 江苏农业学报，2012，28（1）：125-130.

[4]魏 宁，桂文龙，李巨银，等. 新城疫疫苗及免疫程序对蛋鸡免疫效果的研究[J]. 江苏农业科学，2012，40（11）：232-234.

[5]Qiu X，Sun Q，Wu S，et al. Entire genome sequence analysis of genotype IX newcastle disease viruses reveals their early-genotype phylogenetic position and recent-genotype genome size[J]. Virology Journal，2011，8：117.

[6]Peeters B H，de Leeuw O S，Koch G，et al. Rescue of NDV from cloned cDNA：evidence that cleavability of fusion protein is a major determinant for virulence[J]. Virology Journal，1999，73（6）：5001-5009.

[7]Eigen M. Selforganization of matter and the evolution of biological macromolecules[J]. Naturwissenschaften，1971，58（10）：465-523.

[8]Kissi B，Badrane H，Audry L，et al. Dynamics of rabies virus quasispecies during serial passages in heterologous hosts[J]. Journal of General Virology，1999，80（8）：2041-2050.

[9]Liu X，Wang X，Wu S，et al. Surveillance for avirulent newcastle disease viruses in domestic ducks （Anas platyrhynchos and Cairina moschata） at live bird markets in Eastern China and characterization of the viruses isolated[J]. Journal of the W V P A，2009，38（5）：377-391.

[10]aldous E W，Mynn J K，Banks J，et al. A molecular epidemiological study of avian paramyxovirus type 1（newcastle disease virus）isolates by phylogenetic analysis of a partial nucleotide sequence of the fusion protein gene[J]. Journal of the W V P A，2003，32：239-257.

[11]巩艳艳，崔治中. 细胞培养上新城疫病毒HN基因在抗体免疫选择压作用下的抗原表位变异[J]. 中国科学，2009，39（12）：1175-1180.

将此纯化株分别与GenBank上的LaSota（登录号分别为AF077761.1、AY845400.2和JF950510.1）全基因组序列相比，核苷酸的同源性分别为99.2%、99.0%和99.6%，突变主要集中在L和HN蛋白上。3 结论与讨论

准种是同一株病毒在宿主体内表现为一群系统发育密切相关的变异株，它是由一定数量核苷酸相同的优势准种和序列互不相同的劣势准种组成的。RNA依赖的RNA聚合酶因缺乏3′→5′核酸外切酶活性而使复制中产生的错误未能校正、宿主本身的选择（正选择作用）和病毒基因组结构的限制（负选择作用）3种机制会导致优势准种不固定，在一些外界选择压力作用下，劣势准种甚至可替代优势准种。

为了更好地开展该毒株的反向遗传操作技术研究，在病毒纯化过程中，有必要进行几个病毒克隆株的筛选，以获得一株能代表绝大多数病毒克隆株性质的克隆株。首先，在病毒传代过程中考虑到疫苗制备需要，每次应选择病毒稀释度最高、血凝价较高的尿囊液作为传代接种物；其次，扩增基因片段时选择高保真聚合酶，PCR循环数设为25次；最后，为避免PCR 过程可能造成基因的变异以及测序过程中可能带来的突变，对该病毒基因片段至少测序5个阳性克隆，综合多次测序结果获得其全长基因序列，因此所获得的序列应该能够真实反映该病毒株基因组的核苷酸序列。

纯化株序列与种毒株序列以及GenBank 中的3株 LaSota 株序列相比较，结果发现核苷酸发生变异，表明该疫苗株是在自然界的选择压力与免疫压力下对外界环境变化而发生的一种适应性突变。NDV囊膜表面的F和HN等2个糖蛋白容易经受选择压力的作用，同时也是构成NDV主要致病性的分子基础[10]。Peeters 等在1999年发现尤其是F蛋白在NDV致病过程中发挥着重要作用[2]。然而，巩艳艳等在2009年抗体免疫选择压可显著影响HN基因变异，且其受影响程度高于F基因，认为HN基因的变异更能代表NDV 的进化规律和趋势[11]。笔者发现F蛋白没有发生突变，而HN蛋白的突变率最高，碱基突变率达到了0.29%，与巩艳艳等的研究结果[11]一致。本研究结果在一定程度上也表明NDV的进化是多个基因包括调控区共同演化的结果。

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[11]巩艳艳，崔治中. 细胞培养上新城疫病毒HN基因在抗体免疫选择压作用下的抗原表位变异[J]. 中国科学，2009，39（12）：1175-1180.

将此纯化株分别与GenBank上的LaSota（登录号分别为AF077761.1、AY845400.2和JF950510.1）全基因组序列相比，核苷酸的同源性分别为99.2%、99.0%和99.6%，突变主要集中在L和HN蛋白上。3 结论与讨论

准种是同一株病毒在宿主体内表现为一群系统发育密切相关的变异株，它是由一定数量核苷酸相同的优势准种和序列互不相同的劣势准种组成的。RNA依赖的RNA聚合酶因缺乏3′→5′核酸外切酶活性而使复制中产生的错误未能校正、宿主本身的选择（正选择作用）和病毒基因组结构的限制（负选择作用）3种机制会导致优势准种不固定，在一些外界选择压力作用下，劣势准种甚至可替代优势准种。

为了更好地开展该毒株的反向遗传操作技术研究，在病毒纯化过程中，有必要进行几个病毒克隆株的筛选，以获得一株能代表绝大多数病毒克隆株性质的克隆株。首先，在病毒传代过程中考虑到疫苗制备需要，每次应选择病毒稀释度最高、血凝价较高的尿囊液作为传代接种物；其次，扩增基因片段时选择高保真聚合酶，PCR循环数设为25次；最后，为避免PCR 过程可能造成基因的变异以及测序过程中可能带来的突变，对该病毒基因片段至少测序5个阳性克隆，综合多次测序结果获得其全长基因序列，因此所获得的序列应该能够真实反映该病毒株基因组的核苷酸序列。

纯化株序列与种毒株序列以及GenBank 中的3株 LaSota 株序列相比较，结果发现核苷酸发生变异，表明该疫苗株是在自然界的选择压力与免疫压力下对外界环境变化而发生的一种适应性突变。NDV囊膜表面的F和HN等2个糖蛋白容易经受选择压力的作用，同时也是构成NDV主要致病性的分子基础[10]。Peeters 等在1999年发现尤其是F蛋白在NDV致病过程中发挥着重要作用[2]。然而，巩艳艳等在2009年抗体免疫选择压可显著影响HN基因变异，且其受影响程度高于F基因，认为HN基因的变异更能代表NDV 的进化规律和趋势[11]。笔者发现F蛋白没有发生突变，而HN蛋白的突变率最高，碱基突变率达到了0.29%，与巩艳艳等的研究结果[11]一致。本研究结果在一定程度上也表明NDV的进化是多个基因包括调控区共同演化的结果。

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[9]Liu X，Wang X，Wu S，et al. Surveillance for avirulent newcastle disease viruses in domestic ducks （Anas platyrhynchos and Cairina moschata） at live bird markets in Eastern China and characterization of the viruses isolated[J]. Journal of the W V P A，2009，38（5）：377-391.

[10]aldous E W，Mynn J K，Banks J，et al. A molecular epidemiological study of avian paramyxovirus type 1（newcastle disease virus）isolates by phylogenetic analysis of a partial nucleotide sequence of the fusion protein gene[J]. Journal of the W V P A，2003，32：239-257.

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