聂晓伟等

摘要：对菟丝子、淫羊藿水提液进行分离纯化，并将水提液加入大鼠精液冷冻保护剂中，对大鼠附睾尾部精子进行冷冻保存，并评估冷冻前后精子活率指数，采用伊红染色评估精子畸形率。结果表明：添加菟丝子、淫羊藿水提液的冷冻保护剂可以提高解冻后精子活率指数。菟丝子、淫羊藿水提液在大鼠精液冷冻保存过程中有一定的保护作用。

关键词：淫羊藿；菟丝子；大鼠；附睾精子；精子活率指数

中图分类号： R321.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0145-03

精液冷冻保存技术已有200多年的历史。人的精液冷冻保存可以追溯到20世纪40年代末。目前，精液冷冻保存在我国主要应用于人类精子库，目前，已经建立了较为成熟的精液冷冻保存体系。全国各生殖中心对人精液冷冻保护剂的需求量比较大，市场上人精液冷冻保存剂几乎全部被国外的生物公司所垄断，国内只有部分科研院所自行配制畜禽精液冷冻保护剂，还没有我国自行开发的人类精液冷冻保护剂应用于临床。笔者前期研究表明，对少弱精患者进行精液冷冻保存，可以获得尽可能多的处理后活动精子总数（PTMS），并应用于宫腔内人工授精（IUI），使更多的患者可以接受IUI技术治疗，减少治疗费用，让不孕不育患者以最小的代价获得妊娠[1]。现有的人类精液冷冻保存系统适合人的正常精液。本研究探讨中药水提液对大鼠精液冷冻保存效果，旨在为冷冻保存少弱精患者精液提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

15周龄清洁级SD雄性大鼠（南京医科大学实验动物中心），取附睾精子用于冷冻保存研究。菟丝子（安徽井泉集团中药饮片有限公司），批号：20110803。淫羊藿（安徽省万生中药饮片有限公司），批号：20110701。2种药材均购自江苏省中医院药剂科。M16 Medium（Sigma公司），批号：11A832。

1.2 方法

1.2.1 菟丝子、淫羊藿中药提取液的制备 取干净菟丝子、淫羊藿各500 g，分别加8倍蒸馏水（4 000 mL）浸泡30 min，武火煮沸，文火再煮30 min，滤布过滤，滤渣再加5倍量水（2 500 mL），同上法再处理2次，各煮沸30 min，合并3次滤液。将合并的滤液旋蒸，浓缩至1 000 mL。将浓缩液置于冰箱中静置沉淀，去除悬浮粒子（24 h）。将菟丝子滤液于70 ℃水浴中浓缩至 1 g/mL （每mL药液相当于1.00 g生药量），淫羊藿滤液浓缩至 2 g/mL （每mL药液相当于2.00 g生药量）。将浓缩滤液 2 500 r/min 离心20 min，取上清液 200 mL，加入等量蒸馏水稀释后过夜，2 500 r/min离心 20 min 后再30 000 r/min高速离心20 min，提取上清液最终定量为菟丝子0.5 g/mL（每mL药液相当于0.50 g生药量），淫羊藿滤液浓缩至1.00 g/mL（每mL药液相当于1.0 g生药量）。将上清液经0.45 μm滤器过滤，冷藏保存备用。

1.2.2 固体物质含量测定 取菟丝子、淫羊藿水提取液各 2 mL，置恒重的称量瓶中，于120 ℃电热恒温干燥箱中干燥 3 h，使溶液缓慢挥发，直到其中的固体成分完全干燥为止，准确称量，重复2次，取平均值。溶液固含量计算见公式（1）：

固含量=干燥后固体重量/溶液总重量×100%

（1）

1.2.3 稀释液的配制 375.0 mmol/L Tris（51.11 mg/mL）+124.0 mmol/L柠檬酸（26.06 mg/mL）+41.0 mmol/L葡萄糖（8.12 mg/mL）。50 mL稀释液含2.555 5 g Tris+1.303 g柠檬酸+0.406 g葡萄糖。用375.0 mmol/L Tris将稀释液的pH 值调整到7.0，用三蒸水将渗透压调整到375 mOsm。

1.2.4 基础液的配制 基础液Ⅰ：M16培养液+50 μg/mL硫酸链霉素+75 μg/mL青霉素+0.1 mol/L棉籽糖+0.05% SDS+20%卵黄（95%）。基础液Ⅱ：首先自行配制mKRB培养液，配方如下：CaCl2·2H2O 1.71 mmol/L，MgSO4·7H2O 119 mmol/L。KCl 4.78 mmol/L、KH2PO4 1.19 mmol/L、NaHCO3 25.07 mmol/L、NaCl 94.6 mmol/L、葡萄糖 5.56 mmol/L、丙酮酸钠 0.5 mmol/L、乳酸钠 21.58 mmol/L、硫酸链霉素 50 μg/mL、青霉素 75 μg/mL。在mKRB培养液中一次性加入01 mol/L棉籽糖、005% SDS、20%卵黄。基础液Ⅰ、基础液Ⅱ加入卵黄后，连续混匀30 min后6 000 r/min离心30 min，取上清后再次离心30 min，用HCl调整溶液pH值为7.3，然后用 045 μm 滤膜过滤，将配制好的基础液低温保存备用。

1.2.5 试验分组 试验Ⅰ：对照组C1：PBS（5%）+基础液Ⅰ（95%）；菟丝子组T1A：0.5 g/mL菟丝子提取液（1%）+PBS（4%）+基础液Ⅰ（95%）；菟丝子组T1B：0.5 g/mL菟丝子提取液（2.5%）+PBS（2.5%）+基础液Ⅰ（95%）；菟丝子组T1C：0.5 g/mL菟丝子提取液（5%）+基础液Ⅰ（95%）。淫羊藿组Y1A：1 g/mL淫羊藿提取液（1%）+PBS（4%）+基础液Ⅰ（95%）；淫羊藿组Y1B：1 g/mL淫羊藿提取液（25%）+PBS（2.5%）+基础液Ⅰ（95%）；淫羊藿组Y1C：1 g/mL 淫羊藿提取液（5%）+基础液Ⅰ（95%）。将大鼠精液与冷冻液按1 ∶ 1、1 ∶ 2（体积比）混合，分装于冷冻麦管中。

试验Ⅱ：对照组C2：PBS（10%）+基础液Ⅰ（90%）；菟丝子组T2A：0.5 g/mL菟丝子提取液（2.5%）+PBS（7.5%）+基础液Ⅰ（90%）；菟丝子组T2B：0.5 g/mL菟丝子提取液（5%）+PBS（5%）+基础液Ⅰ（90%）；菟丝子组T2C：0.5 g/mL 菟丝子提取液（10%）+基础液Ⅰ（90%）。淫羊藿组Y2A：1 g/mL淫羊藿提取液（2.5%）+PBS（7.5%）+基础液Ⅰ（90%）；淫羊藿组Y2B：1 g/mL淫羊藿提取液（5%）+PBS（5%）+基础液Ⅰ（90%）；淫羊藿组Y2C：1 g/mL淫羊藿提取液（10%）+基础液Ⅰ（90%）。将大鼠精液与冷冻液按 1 ∶ 1、1 ∶ 2（体积比）混合，分装于冷冻麦管中。endprint

试验Ⅲ：对照组C3：基础液Ⅱ；菟丝子组T3A：0.5 g/mL菟丝子提取液（0.5%）+基础液Ⅱ（99.5%）；菟丝子组T3B：0.5 g/mL菟丝子提取液（1%）+基础液Ⅱ（99%）；菟丝子组T3C：0.5 g/mL菟丝子提取液（1.5%）+基础液Ⅱ（98.5%）。淫羊藿组Y3A：1 g/mL淫羊藿提取液（1.5%）+基础液Ⅱ（98.5%）；淫羊藿组Y3B：1 g/mL淫羊藿提取液（2.5%）+基础液Ⅱ（97.5%）；淫羊藿组Y3C：1 g/mL淫羊藿提取液（35%）+基础液Ⅱ（96.5%）。

各组精液冷冻保护液配制完成后，均经0.22 μm滤器过滤后备用。

1.2.6 附睾尾部精子的获取与稀释 每只大鼠用2 mL 10%水合氯醛腹腔麻醉后解剖，分离附睾尾，放置于盛有2 mL稀释液的353037培养皿中，取附睾尾部浆液分析测定精子密度（N）、精子活率（SMI），用稀释液将精子密度调整到2 000万/mL备用。使用Makler计数板调整密度。

1.2.7 装管 将精液与冷冻保护液按照1 ∶ 2（体积比）分装于冷冻麦管和冷冻管中。

1.2.8 冷冻与解冻 将分装好的麦管或冷冻管放入4 ℃冰箱30 min，在距离液氮表面1～2 cm的液氮蒸汽中熏蒸 10 min，然后直接投入液氮中。将冷冻麦管从液氮中取出，37 ℃ 水浴中静置10 s，然后将冻存精液转移到353037培养皿中，在37 ℃培养箱中培养10 min，检测解冻后精子活率及畸形率。将冷冻管从液氮中取出，37 ℃水浴中静置10 min，完全解冻后检测精子活率及畸形率。

1.2.9 精子活率测定 滴1滴精液于载玻片表面，加载盖玻片，记录活动精子数、前向活动精子数、不活动精子数，精子活率指数计算公式如下：

2.6 菟丝子、淫羊藿水提液最佳添加浓度的确定

添加1%菟丝子提取液、2.5%淫羊藿提取液的冷冻保护剂解冻后可以见到活动精子。添加1%菟丝子提取液（T3B）的冷冻保护剂解冻后精子活率指数最高，与其他组差异显著；添加3.5%淫羊藿提取液（Y3C）的冷冻保护剂解冻后精子活率指数最高，但与2.5%淫羊藿提取液（Y3B）组无显著差异。

3 结果与分析

比其他哺乳动物精子相比，大鼠精子尾巴更加细长，且头部呈狭小细长的镰刀状[2-3]。这些结构上的特殊性决定其对一些环境变化极其敏感，如物理损伤、pH值变化、渗透压变化、温度变化等[4-5]。研究人员对大鼠精子进行不同程度离心，结果表明，700 r/min 离心5 min 后精子活力明显低于未离心组，离心3 次后精子质膜完整性近乎0。因此，大鼠精子冷冻过程中应尽量避免外界损伤。大鼠精子冷冻难度较大，主要是由于精子质膜的脂质含量、成分不同造成的[6]。陈荪红将大鼠、小鼠、人类精子在人类精子的低渗肿胀检测液中孵育30 min 后，人类精子尾部出现尾间弯曲肿胀或完全肿胀，小鼠精子也出现类似人类精子现象，而大鼠精子与上述2种精子明显不同，其尾部未出现任何弯曲肿胀现象[7]。Hammerstedt 等对不同动物精子质膜的磷脂成分进行比较，发现大鼠精子质膜与牛、羊等有明显区别，说明大鼠精子冻存难度较大与其成分特异的细胞膜有关[8]。大鼠作为体型适中的试验动物被应用于很多研究领域，再加上人类疾病模型的增多，需要建立成熟的保种方法。然而，大鼠精子结构的特殊性导致其精子冷冻还处于探索阶段，如果了解了大鼠精子细胞生物膜结构，然后针对该特性进行生物学机理研究，有可能取得突破性进展，开发出适合的冷冻程序、冷冻保护剂。在以后的工作中，应选择菟丝子、淫羊藿、丹参等单味中药的有效成分用于大鼠精液冷冻保存研究。

参考文献：

[1]聂晓伟，钱 云，刘承勇，等. 少弱精子冷冻保存在宫腔内人工授精中的应用[J]. 中华男科学杂志，2010，16（3）：232-235.

[2]Parks J E，Graham J K. Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes[J]. Theriogenology，1992，38（2）：209-222.

[3]Niwa K，Chang M C. Various conditions for the fertilization of rat egg in vitro[J]. Biology of Reproduction，1974，11：463-469.

[4]Chulavatnatol M. Motility initiation of quiescent spermatozoa from rat caudal epididymis：effects of pH，viscosity，osmolality and inhibitors[J]. International Journal of Andrology，1982，5（4）：425-436.

[5]Si W，Benson J D，Men H，et al. Osmotic tolerance limits and effects of cryoprotectants on the motility，plasma membrane integrity and acrosomal integrity of rat sperm[J]. Cryobiology，2006，53（3）：336-348.

[6]Parks J E，Lynch D V. Lipid composition and thermotropic phase behavior of boar，bull，stallion，and rooster sperm membranes[J]. Cryobiology，1992，29（2）：255-266.

[7]陈荪红. 冻存对自发性高血压大鼠配子和着床前胚胎的影响[D]. 上海：上海第二医科大学，2002.

[8]Hammerstedt R H，Graham J K，Nolan J P. Cryopreservation of mammalian sperm：what we ask them to survive[J]. Journal of Andrology，1990，11（1）：73-88.endprint

试验Ⅲ：对照组C3：基础液Ⅱ；菟丝子组T3A：0.5 g/mL菟丝子提取液（0.5%）+基础液Ⅱ（99.5%）；菟丝子组T3B：0.5 g/mL菟丝子提取液（1%）+基础液Ⅱ（99%）；菟丝子组T3C：0.5 g/mL菟丝子提取液（1.5%）+基础液Ⅱ（98.5%）。淫羊藿组Y3A：1 g/mL淫羊藿提取液（1.5%）+基础液Ⅱ（98.5%）；淫羊藿组Y3B：1 g/mL淫羊藿提取液（2.5%）+基础液Ⅱ（97.5%）；淫羊藿组Y3C：1 g/mL淫羊藿提取液（35%）+基础液Ⅱ（96.5%）。

各组精液冷冻保护液配制完成后，均经0.22 μm滤器过滤后备用。

1.2.6 附睾尾部精子的获取与稀释 每只大鼠用2 mL 10%水合氯醛腹腔麻醉后解剖，分离附睾尾，放置于盛有2 mL稀释液的353037培养皿中，取附睾尾部浆液分析测定精子密度（N）、精子活率（SMI），用稀释液将精子密度调整到2 000万/mL备用。使用Makler计数板调整密度。

1.2.7 装管 将精液与冷冻保护液按照1 ∶ 2（体积比）分装于冷冻麦管和冷冻管中。

1.2.8 冷冻与解冻 将分装好的麦管或冷冻管放入4 ℃冰箱30 min，在距离液氮表面1～2 cm的液氮蒸汽中熏蒸 10 min，然后直接投入液氮中。将冷冻麦管从液氮中取出，37 ℃ 水浴中静置10 s，然后将冻存精液转移到353037培养皿中，在37 ℃培养箱中培养10 min，检测解冻后精子活率及畸形率。将冷冻管从液氮中取出，37 ℃水浴中静置10 min，完全解冻后检测精子活率及畸形率。

1.2.9 精子活率测定 滴1滴精液于载玻片表面，加载盖玻片，记录活动精子数、前向活动精子数、不活动精子数，精子活率指数计算公式如下：

2.6 菟丝子、淫羊藿水提液最佳添加浓度的确定

添加1%菟丝子提取液、2.5%淫羊藿提取液的冷冻保护剂解冻后可以见到活动精子。添加1%菟丝子提取液（T3B）的冷冻保护剂解冻后精子活率指数最高，与其他组差异显著；添加3.5%淫羊藿提取液（Y3C）的冷冻保护剂解冻后精子活率指数最高，但与2.5%淫羊藿提取液（Y3B）组无显著差异。

3 结果与分析

比其他哺乳动物精子相比，大鼠精子尾巴更加细长，且头部呈狭小细长的镰刀状[2-3]。这些结构上的特殊性决定其对一些环境变化极其敏感，如物理损伤、pH值变化、渗透压变化、温度变化等[4-5]。研究人员对大鼠精子进行不同程度离心，结果表明，700 r/min 离心5 min 后精子活力明显低于未离心组，离心3 次后精子质膜完整性近乎0。因此，大鼠精子冷冻过程中应尽量避免外界损伤。大鼠精子冷冻难度较大，主要是由于精子质膜的脂质含量、成分不同造成的[6]。陈荪红将大鼠、小鼠、人类精子在人类精子的低渗肿胀检测液中孵育30 min 后，人类精子尾部出现尾间弯曲肿胀或完全肿胀，小鼠精子也出现类似人类精子现象，而大鼠精子与上述2种精子明显不同，其尾部未出现任何弯曲肿胀现象[7]。Hammerstedt 等对不同动物精子质膜的磷脂成分进行比较，发现大鼠精子质膜与牛、羊等有明显区别，说明大鼠精子冻存难度较大与其成分特异的细胞膜有关[8]。大鼠作为体型适中的试验动物被应用于很多研究领域，再加上人类疾病模型的增多，需要建立成熟的保种方法。然而，大鼠精子结构的特殊性导致其精子冷冻还处于探索阶段，如果了解了大鼠精子细胞生物膜结构，然后针对该特性进行生物学机理研究，有可能取得突破性进展，开发出适合的冷冻程序、冷冻保护剂。在以后的工作中，应选择菟丝子、淫羊藿、丹参等单味中药的有效成分用于大鼠精液冷冻保存研究。

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[7]陈荪红. 冻存对自发性高血压大鼠配子和着床前胚胎的影响[D]. 上海：上海第二医科大学，2002.

[8]Hammerstedt R H，Graham J K，Nolan J P. Cryopreservation of mammalian sperm：what we ask them to survive[J]. Journal of Andrology，1990，11（1）：73-88.endprint

试验Ⅲ：对照组C3：基础液Ⅱ；菟丝子组T3A：0.5 g/mL菟丝子提取液（0.5%）+基础液Ⅱ（99.5%）；菟丝子组T3B：0.5 g/mL菟丝子提取液（1%）+基础液Ⅱ（99%）；菟丝子组T3C：0.5 g/mL菟丝子提取液（1.5%）+基础液Ⅱ（98.5%）。淫羊藿组Y3A：1 g/mL淫羊藿提取液（1.5%）+基础液Ⅱ（98.5%）；淫羊藿组Y3B：1 g/mL淫羊藿提取液（2.5%）+基础液Ⅱ（97.5%）；淫羊藿组Y3C：1 g/mL淫羊藿提取液（35%）+基础液Ⅱ（96.5%）。

各组精液冷冻保护液配制完成后，均经0.22 μm滤器过滤后备用。

1.2.6 附睾尾部精子的获取与稀释 每只大鼠用2 mL 10%水合氯醛腹腔麻醉后解剖，分离附睾尾，放置于盛有2 mL稀释液的353037培养皿中，取附睾尾部浆液分析测定精子密度（N）、精子活率（SMI），用稀释液将精子密度调整到2 000万/mL备用。使用Makler计数板调整密度。

1.2.7 装管 将精液与冷冻保护液按照1 ∶ 2（体积比）分装于冷冻麦管和冷冻管中。

1.2.8 冷冻与解冻 将分装好的麦管或冷冻管放入4 ℃冰箱30 min，在距离液氮表面1～2 cm的液氮蒸汽中熏蒸 10 min，然后直接投入液氮中。将冷冻麦管从液氮中取出，37 ℃ 水浴中静置10 s，然后将冻存精液转移到353037培养皿中，在37 ℃培养箱中培养10 min，检测解冻后精子活率及畸形率。将冷冻管从液氮中取出，37 ℃水浴中静置10 min，完全解冻后检测精子活率及畸形率。

1.2.9 精子活率测定 滴1滴精液于载玻片表面，加载盖玻片，记录活动精子数、前向活动精子数、不活动精子数，精子活率指数计算公式如下：

2.6 菟丝子、淫羊藿水提液最佳添加浓度的确定

添加1%菟丝子提取液、2.5%淫羊藿提取液的冷冻保护剂解冻后可以见到活动精子。添加1%菟丝子提取液（T3B）的冷冻保护剂解冻后精子活率指数最高，与其他组差异显著；添加3.5%淫羊藿提取液（Y3C）的冷冻保护剂解冻后精子活率指数最高，但与2.5%淫羊藿提取液（Y3B）组无显著差异。

3 结果与分析

比其他哺乳动物精子相比，大鼠精子尾巴更加细长，且头部呈狭小细长的镰刀状[2-3]。这些结构上的特殊性决定其对一些环境变化极其敏感，如物理损伤、pH值变化、渗透压变化、温度变化等[4-5]。研究人员对大鼠精子进行不同程度离心，结果表明，700 r/min 离心5 min 后精子活力明显低于未离心组，离心3 次后精子质膜完整性近乎0。因此，大鼠精子冷冻过程中应尽量避免外界损伤。大鼠精子冷冻难度较大，主要是由于精子质膜的脂质含量、成分不同造成的[6]。陈荪红将大鼠、小鼠、人类精子在人类精子的低渗肿胀检测液中孵育30 min 后，人类精子尾部出现尾间弯曲肿胀或完全肿胀，小鼠精子也出现类似人类精子现象，而大鼠精子与上述2种精子明显不同，其尾部未出现任何弯曲肿胀现象[7]。Hammerstedt 等对不同动物精子质膜的磷脂成分进行比较，发现大鼠精子质膜与牛、羊等有明显区别，说明大鼠精子冻存难度较大与其成分特异的细胞膜有关[8]。大鼠作为体型适中的试验动物被应用于很多研究领域，再加上人类疾病模型的增多，需要建立成熟的保种方法。然而，大鼠精子结构的特殊性导致其精子冷冻还处于探索阶段，如果了解了大鼠精子细胞生物膜结构，然后针对该特性进行生物学机理研究，有可能取得突破性进展，开发出适合的冷冻程序、冷冻保护剂。在以后的工作中，应选择菟丝子、淫羊藿、丹参等单味中药的有效成分用于大鼠精液冷冻保存研究。

参考文献：

[1]聂晓伟，钱 云，刘承勇，等. 少弱精子冷冻保存在宫腔内人工授精中的应用[J]. 中华男科学杂志，2010，16（3）：232-235.

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[4]Chulavatnatol M. Motility initiation of quiescent spermatozoa from rat caudal epididymis：effects of pH，viscosity，osmolality and inhibitors[J]. International Journal of Andrology，1982，5（4）：425-436.

[5]Si W，Benson J D，Men H，et al. Osmotic tolerance limits and effects of cryoprotectants on the motility，plasma membrane integrity and acrosomal integrity of rat sperm[J]. Cryobiology，2006，53（3）：336-348.

[6]Parks J E，Lynch D V. Lipid composition and thermotropic phase behavior of boar，bull，stallion，and rooster sperm membranes[J]. Cryobiology，1992，29（2）：255-266.

[7]陈荪红. 冻存对自发性高血压大鼠配子和着床前胚胎的影响[D]. 上海：上海第二医科大学，2002.

[8]Hammerstedt R H，Graham J K，Nolan J P. Cryopreservation of mammalian sperm：what we ask them to survive[J]. Journal of Andrology，1990，11（1）：73-88.endprint