潘晓曦+关一鸣+吴连举

摘要：菌株B-09是1株从人参根际土壤中筛选出的生防菌。为明确B-09菌株在人参灰霉病生防应用中的潜力，进行了B-09室内抑菌效果和温室防治效果试验。结果表明，室内抑菌试验B-09活体菌株对人参灰霉病病原菌的抑菌圈直径达32 mm；B-09无菌发酵液对人参灰霉病病原菌菌丝生长的抑制率达90%以上，对人参灰霉病病原菌孢子萌发的抑制率达87%以上。在温室控病试验中，B-09无菌发酵液对人参灰霉病的防治效果达78.6%左右，与化学药剂处理组效果相当，表明供试生防菌可开发为生物农药的潜力。

关键词：生防菌；人参灰霉病；抑菌作用；生物防治

中图分类号： S435.675 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0074-02

人参为五加科多年生草本植物，以根茎、叶、花、果实入药，具有大补元气、复脉固脱、补气益血、生津、安神等功效[1]。人参灰霉病是20世纪80年代国内新发现的病害，该病以危害人参的叶片、叶柄、花、果实为主，严重时危害根部，1981—1988年吉林省栽培人参该病的发病率达20%～30%。自2002年以来，吉林省人参灰霉病发生频繁，已成为影响人参产量的主要病害之一[2]。目前，该病的防治主要以化学防治为主，由于长期大量使用化学农药，给生态环境、药材品质带来了不可忽视的危害；另外因植物病原菌对常用化学药剂抗药性的逐渐增强，使其防效不断下降。因此，有针对性地使用生物农药，开发微生物杀菌剂是植物病害防治的必然趋势。试验以抗菌谱较广的生防菌B-09为材料，对菌株的抑菌活性和控病作用开展了研究，明确了生防菌B-09对人参灰霉病的抑制效果，为进一步开发生物农药奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试生防菌枯草芽孢杆菌B-09，分离自吉林省抚松县人参根际土壤。供试病原菌人参灰霉病病原菌，分离自吉林省吉安市人参种植基地人参灰霉病病株。化学药剂。80%多菌灵可湿性粉剂，北京绿怡园科技发展有限公司生产。培养基。PDA培养基、NA培养基、营养肉汤培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 生防菌B-09无菌发酵液的制备 将菌株B-09接种于NA培养基活化24 h后，取直径3mm的菌饼转接于营养肉汤培养基中，于37 ℃、200 r/min振荡培养72 h，离心后取上清液，再用0.22 μm微孔滤膜滤去上清液中残留菌体，制得B-09无菌发酵液。

1.2.2 B-09菌株平板内拮抗作用 利用平板对峙法[3]，在PDA平板中央接种直径为6 mm的病原菌菌饼，距菌饼 25 mm 处用接种针点接生防菌，以不接生防菌的PDA平板作为空白对照，于25 ℃温箱培养，6 d后检测生防菌株对病原菌菌丝生长的抑制作用，并测定抑菌圈直径大小。每处理3次重复（下同）。

1.2.3 B-09无菌发酵液对病原菌菌丝生长的抑制作用 将B-09无菌发酵液与冷却至50 ℃左右的PDA培养基分别以1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 10、1 ∶ 18的体积比混匀（发酵液终浓度为20%、14%、9%、5%）倒平板，冷却后于平板中央接种直径 6 mm 病原菌菌饼，以装有营养肉汤培养基与PDA培养基混合物的平板为对照，比例同上，于“1.2.2”节的条件下培养 6 d 后测量各处理病原菌菌丝直径，并计算抑制率。

1.2.4 B-09无菌发酵液对病原菌孢子萌发的抑制作用 用无菌水配制灰霉病病原菌孢子悬浮液，浓度为1×106 CFU/mL。将B-09无菌发酵液100%、50%、25%的稀释液与等体积的灰霉病病原菌孢子悬浮液混合（发酵液终浓度为50%、25%、125%），用载玻片悬滴法[4]于25 ℃培养，以加入营养肉汤培养基的孢子悬浮液为对照，24 h后镜检孢子萌发情况。

1.2.5 B-09无菌发酵液对人参灰霉病防治试验 取3年生人参盆栽苗，每株人参苗针刺8个伤口，用人参灰霉病病原菌孢子悬浮液（浓度约为2×105 CFU/mL）喷洒接种，接种后保湿，36 h 后喷洒B-09无菌发酵液，6株为1处理，每处理设3次重复。10 d后观察发病情况，统计发病率和病情指数，并计算防治效果[5-6]。对照组和化学药剂组分别喷洒无菌水与多菌灵1 000倍液。病情分级标准如下[7]：0级，无病斑；1级，病斑面积占整个叶面积5%以下；3级，病斑面积占整个叶面积6%～10%；5级，病斑面积占整个叶面积11%～20%；7级，病斑面积占整个叶面积21%～50%；9级，病斑面积占整个叶面积50%以上。

2 结果与分析

2.1 B-09菌株平板内抑菌效果

从图1可见，生防菌与灰霉病病原菌对峙培养6 d后，在生防菌周围形成直径为32 mm的透明抑菌圈，且直径大小不随时间的推移而改变。显微镜下观察可见，抑菌圈周围的病原菌菌丝生长缓慢，部分菌丝顶端膨大，并且细胞壁被破坏，原生质体外泄，表现出溶菌现象（图2）。

2.2 B-09菌株无菌发酵液对病原菌菌丝生长的抑制作用

从表1可见，B-09无菌发酵液在5.0%的浓度下对菌丝生长有抑制作用，但效果不明显；在14%、20%浓度下的抑菌效果较好，且二者没有显著差异。表明分无菌发酵液在14%的浓度下已能有效抑制病原菌菌丝的生长。

3 讨论与结论

近年来，某些国家正在逐渐淘汰化学农药，越来越多采用生物农药和生物肥料等生物防治措施控制和消灭植物病虫害，并取得了显著进展[8-9]。生物农药包括细菌农药、真菌农药、病毒农药和抗生素农药四大类。由于生物农药具有选择性强、效率高、成本低、不污染环境、对人畜无害等特点，某些国家正越来越多地将其应用于农作物防病、治虫、防草等方面，推广应用前景广泛。

生防菌B-09是从200余个人参土壤根际菌中经过反复筛选后获得的抗菌活性很强的菌株。试验结果表明，供试菌株的活菌体能够良好地抑制人参灰霉病病原菌菌丝的生长能力；菌株的无菌发酵液对人参灰霉病病原菌菌丝生长与孢子萌发均表现出显著的抑制作用。在温室盆栽试验中，B-09无菌发酵液对人参灰霉病的防治效果达到78.6%，与常用化学农药效果相当，但温室是一个相对可控的系统，影响因素相对于田间要少，菌株B-09虽然具有一定开发为生物农药的潜力，但防控效果还需要进一步进行田间试验来验证。

参考文献：

[1]杨春澍.药用植物学[M]. 上海：上海科学技术出版社，1998：251-252.

[2]徐怀友，马友德，张 辉，等. 人参灰霉病安全高效防治药剂组合筛选研究[J]. 吉林农业大学学报，2008，30（专辑）：44-47.

3]李小俊，成丽霞，吴彦彬，等. 拮抗菌抗菌谱及发酵液拮抗能力测定的新方法[J]. 生物技术，2007，17（1）：55-58.

[4]方中达. 植病研究方法[M]. 北京：中国农业出版社，1998：152.

[5]Brunner K，Zeilinger S，Ciliento R，et al. Improvement of the Fungal Biocontrol Agent Trichoderma atroviride to Enhance both Antagonism and Induction of Plant Systemic Disease Resistance[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（7）：3959-3962.

[6]农业部农药检定所. 农药田间药效试验准则（一）[M]. 北京：中国标准出版社. 1998：45-51.

[7]王存兴，李光武. 植物病理学[M]. 北京：化学工业出版社. 2012：92-94.

[8]陈志谊，张荣胜. 植物病害生防芽孢杆菌研究进展[J]. 江苏农业学报，2012，28（5）：999-1006.

[9]杨敬辉，吉沐祥，文平兰，等. 黄麻链霉菌NF0919菌株对水稻纹枯病的生防活性[J]. 江苏农业学报，2012，28（6）：1288-1293.

摘要：菌株B-09是1株从人参根际土壤中筛选出的生防菌。为明确B-09菌株在人参灰霉病生防应用中的潜力，进行了B-09室内抑菌效果和温室防治效果试验。结果表明，室内抑菌试验B-09活体菌株对人参灰霉病病原菌的抑菌圈直径达32 mm；B-09无菌发酵液对人参灰霉病病原菌菌丝生长的抑制率达90%以上，对人参灰霉病病原菌孢子萌发的抑制率达87%以上。在温室控病试验中，B-09无菌发酵液对人参灰霉病的防治效果达78.6%左右，与化学药剂处理组效果相当，表明供试生防菌可开发为生物农药的潜力。

关键词：生防菌；人参灰霉病；抑菌作用；生物防治

中图分类号： S435.675 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0074-02

人参为五加科多年生草本植物，以根茎、叶、花、果实入药，具有大补元气、复脉固脱、补气益血、生津、安神等功效[1]。人参灰霉病是20世纪80年代国内新发现的病害，该病以危害人参的叶片、叶柄、花、果实为主，严重时危害根部，1981—1988年吉林省栽培人参该病的发病率达20%～30%。自2002年以来，吉林省人参灰霉病发生频繁，已成为影响人参产量的主要病害之一[2]。目前，该病的防治主要以化学防治为主，由于长期大量使用化学农药，给生态环境、药材品质带来了不可忽视的危害；另外因植物病原菌对常用化学药剂抗药性的逐渐增强，使其防效不断下降。因此，有针对性地使用生物农药，开发微生物杀菌剂是植物病害防治的必然趋势。试验以抗菌谱较广的生防菌B-09为材料，对菌株的抑菌活性和控病作用开展了研究，明确了生防菌B-09对人参灰霉病的抑制效果，为进一步开发生物农药奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试生防菌枯草芽孢杆菌B-09，分离自吉林省抚松县人参根际土壤。供试病原菌人参灰霉病病原菌，分离自吉林省吉安市人参种植基地人参灰霉病病株。化学药剂。80%多菌灵可湿性粉剂，北京绿怡园科技发展有限公司生产。培养基。PDA培养基、NA培养基、营养肉汤培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 生防菌B-09无菌发酵液的制备 将菌株B-09接种于NA培养基活化24 h后，取直径3mm的菌饼转接于营养肉汤培养基中，于37 ℃、200 r/min振荡培养72 h，离心后取上清液，再用0.22 μm微孔滤膜滤去上清液中残留菌体，制得B-09无菌发酵液。

1.2.2 B-09菌株平板内拮抗作用 利用平板对峙法[3]，在PDA平板中央接种直径为6 mm的病原菌菌饼，距菌饼 25 mm 处用接种针点接生防菌，以不接生防菌的PDA平板作为空白对照，于25 ℃温箱培养，6 d后检测生防菌株对病原菌菌丝生长的抑制作用，并测定抑菌圈直径大小。每处理3次重复（下同）。

1.2.3 B-09无菌发酵液对病原菌菌丝生长的抑制作用 将B-09无菌发酵液与冷却至50 ℃左右的PDA培养基分别以1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 10、1 ∶ 18的体积比混匀（发酵液终浓度为20%、14%、9%、5%）倒平板，冷却后于平板中央接种直径 6 mm 病原菌菌饼，以装有营养肉汤培养基与PDA培养基混合物的平板为对照，比例同上，于“1.2.2”节的条件下培养 6 d 后测量各处理病原菌菌丝直径，并计算抑制率。

1.2.4 B-09无菌发酵液对病原菌孢子萌发的抑制作用 用无菌水配制灰霉病病原菌孢子悬浮液，浓度为1×106 CFU/mL。将B-09无菌发酵液100%、50%、25%的稀释液与等体积的灰霉病病原菌孢子悬浮液混合（发酵液终浓度为50%、25%、125%），用载玻片悬滴法[4]于25 ℃培养，以加入营养肉汤培养基的孢子悬浮液为对照，24 h后镜检孢子萌发情况。

1.2.5 B-09无菌发酵液对人参灰霉病防治试验 取3年生人参盆栽苗，每株人参苗针刺8个伤口，用人参灰霉病病原菌孢子悬浮液（浓度约为2×105 CFU/mL）喷洒接种，接种后保湿，36 h 后喷洒B-09无菌发酵液，6株为1处理，每处理设3次重复。10 d后观察发病情况，统计发病率和病情指数，并计算防治效果[5-6]。对照组和化学药剂组分别喷洒无菌水与多菌灵1 000倍液。病情分级标准如下[7]：0级，无病斑；1级，病斑面积占整个叶面积5%以下；3级，病斑面积占整个叶面积6%～10%；5级，病斑面积占整个叶面积11%～20%；7级，病斑面积占整个叶面积21%～50%；9级，病斑面积占整个叶面积50%以上。

2 结果与分析

2.1 B-09菌株平板内抑菌效果

从图1可见，生防菌与灰霉病病原菌对峙培养6 d后，在生防菌周围形成直径为32 mm的透明抑菌圈，且直径大小不随时间的推移而改变。显微镜下观察可见，抑菌圈周围的病原菌菌丝生长缓慢，部分菌丝顶端膨大，并且细胞壁被破坏，原生质体外泄，表现出溶菌现象（图2）。

2.2 B-09菌株无菌发酵液对病原菌菌丝生长的抑制作用

从表1可见，B-09无菌发酵液在5.0%的浓度下对菌丝生长有抑制作用，但效果不明显；在14%、20%浓度下的抑菌效果较好，且二者没有显著差异。表明分无菌发酵液在14%的浓度下已能有效抑制病原菌菌丝的生长。

3 讨论与结论

近年来，某些国家正在逐渐淘汰化学农药，越来越多采用生物农药和生物肥料等生物防治措施控制和消灭植物病虫害，并取得了显著进展[8-9]。生物农药包括细菌农药、真菌农药、病毒农药和抗生素农药四大类。由于生物农药具有选择性强、效率高、成本低、不污染环境、对人畜无害等特点，某些国家正越来越多地将其应用于农作物防病、治虫、防草等方面，推广应用前景广泛。

生防菌B-09是从200余个人参土壤根际菌中经过反复筛选后获得的抗菌活性很强的菌株。试验结果表明，供试菌株的活菌体能够良好地抑制人参灰霉病病原菌菌丝的生长能力；菌株的无菌发酵液对人参灰霉病病原菌菌丝生长与孢子萌发均表现出显著的抑制作用。在温室盆栽试验中，B-09无菌发酵液对人参灰霉病的防治效果达到78.6%，与常用化学农药效果相当，但温室是一个相对可控的系统，影响因素相对于田间要少，菌株B-09虽然具有一定开发为生物农药的潜力，但防控效果还需要进一步进行田间试验来验证。

参考文献：

[1]杨春澍.药用植物学[M]. 上海：上海科学技术出版社，1998：251-252.

[2]徐怀友，马友德，张 辉，等. 人参灰霉病安全高效防治药剂组合筛选研究[J]. 吉林农业大学学报，2008，30（专辑）：44-47.

3]李小俊，成丽霞，吴彦彬，等. 拮抗菌抗菌谱及发酵液拮抗能力测定的新方法[J]. 生物技术，2007，17（1）：55-58.

[4]方中达. 植病研究方法[M]. 北京：中国农业出版社，1998：152.

[5]Brunner K，Zeilinger S，Ciliento R，et al. Improvement of the Fungal Biocontrol Agent Trichoderma atroviride to Enhance both Antagonism and Induction of Plant Systemic Disease Resistance[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（7）：3959-3962.

[6]农业部农药检定所. 农药田间药效试验准则（一）[M]. 北京：中国标准出版社. 1998：45-51.

[7]王存兴，李光武. 植物病理学[M]. 北京：化学工业出版社. 2012：92-94.

[8]陈志谊，张荣胜. 植物病害生防芽孢杆菌研究进展[J]. 江苏农业学报，2012，28（5）：999-1006.

[9]杨敬辉，吉沐祥，文平兰，等. 黄麻链霉菌NF0919菌株对水稻纹枯病的生防活性[J]. 江苏农业学报，2012，28（6）：1288-1293.

摘要：菌株B-09是1株从人参根际土壤中筛选出的生防菌。为明确B-09菌株在人参灰霉病生防应用中的潜力，进行了B-09室内抑菌效果和温室防治效果试验。结果表明，室内抑菌试验B-09活体菌株对人参灰霉病病原菌的抑菌圈直径达32 mm；B-09无菌发酵液对人参灰霉病病原菌菌丝生长的抑制率达90%以上，对人参灰霉病病原菌孢子萌发的抑制率达87%以上。在温室控病试验中，B-09无菌发酵液对人参灰霉病的防治效果达78.6%左右，与化学药剂处理组效果相当，表明供试生防菌可开发为生物农药的潜力。

关键词：生防菌；人参灰霉病；抑菌作用；生物防治

中图分类号： S435.675 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0074-02

人参为五加科多年生草本植物，以根茎、叶、花、果实入药，具有大补元气、复脉固脱、补气益血、生津、安神等功效[1]。人参灰霉病是20世纪80年代国内新发现的病害，该病以危害人参的叶片、叶柄、花、果实为主，严重时危害根部，1981—1988年吉林省栽培人参该病的发病率达20%～30%。自2002年以来，吉林省人参灰霉病发生频繁，已成为影响人参产量的主要病害之一[2]。目前，该病的防治主要以化学防治为主，由于长期大量使用化学农药，给生态环境、药材品质带来了不可忽视的危害；另外因植物病原菌对常用化学药剂抗药性的逐渐增强，使其防效不断下降。因此，有针对性地使用生物农药，开发微生物杀菌剂是植物病害防治的必然趋势。试验以抗菌谱较广的生防菌B-09为材料，对菌株的抑菌活性和控病作用开展了研究，明确了生防菌B-09对人参灰霉病的抑制效果，为进一步开发生物农药奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试生防菌枯草芽孢杆菌B-09，分离自吉林省抚松县人参根际土壤。供试病原菌人参灰霉病病原菌，分离自吉林省吉安市人参种植基地人参灰霉病病株。化学药剂。80%多菌灵可湿性粉剂，北京绿怡园科技发展有限公司生产。培养基。PDA培养基、NA培养基、营养肉汤培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 生防菌B-09无菌发酵液的制备 将菌株B-09接种于NA培养基活化24 h后，取直径3mm的菌饼转接于营养肉汤培养基中，于37 ℃、200 r/min振荡培养72 h，离心后取上清液，再用0.22 μm微孔滤膜滤去上清液中残留菌体，制得B-09无菌发酵液。

1.2.2 B-09菌株平板内拮抗作用 利用平板对峙法[3]，在PDA平板中央接种直径为6 mm的病原菌菌饼，距菌饼 25 mm 处用接种针点接生防菌，以不接生防菌的PDA平板作为空白对照，于25 ℃温箱培养，6 d后检测生防菌株对病原菌菌丝生长的抑制作用，并测定抑菌圈直径大小。每处理3次重复（下同）。

1.2.3 B-09无菌发酵液对病原菌菌丝生长的抑制作用 将B-09无菌发酵液与冷却至50 ℃左右的PDA培养基分别以1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 10、1 ∶ 18的体积比混匀（发酵液终浓度为20%、14%、9%、5%）倒平板，冷却后于平板中央接种直径 6 mm 病原菌菌饼，以装有营养肉汤培养基与PDA培养基混合物的平板为对照，比例同上，于“1.2.2”节的条件下培养 6 d 后测量各处理病原菌菌丝直径，并计算抑制率。

1.2.4 B-09无菌发酵液对病原菌孢子萌发的抑制作用 用无菌水配制灰霉病病原菌孢子悬浮液，浓度为1×106 CFU/mL。将B-09无菌发酵液100%、50%、25%的稀释液与等体积的灰霉病病原菌孢子悬浮液混合（发酵液终浓度为50%、25%、125%），用载玻片悬滴法[4]于25 ℃培养，以加入营养肉汤培养基的孢子悬浮液为对照，24 h后镜检孢子萌发情况。

1.2.5 B-09无菌发酵液对人参灰霉病防治试验 取3年生人参盆栽苗，每株人参苗针刺8个伤口，用人参灰霉病病原菌孢子悬浮液（浓度约为2×105 CFU/mL）喷洒接种，接种后保湿，36 h 后喷洒B-09无菌发酵液，6株为1处理，每处理设3次重复。10 d后观察发病情况，统计发病率和病情指数，并计算防治效果[5-6]。对照组和化学药剂组分别喷洒无菌水与多菌灵1 000倍液。病情分级标准如下[7]：0级，无病斑；1级，病斑面积占整个叶面积5%以下；3级，病斑面积占整个叶面积6%～10%；5级，病斑面积占整个叶面积11%～20%；7级，病斑面积占整个叶面积21%～50%；9级，病斑面积占整个叶面积50%以上。

2 结果与分析

2.1 B-09菌株平板内抑菌效果

从图1可见，生防菌与灰霉病病原菌对峙培养6 d后，在生防菌周围形成直径为32 mm的透明抑菌圈，且直径大小不随时间的推移而改变。显微镜下观察可见，抑菌圈周围的病原菌菌丝生长缓慢，部分菌丝顶端膨大，并且细胞壁被破坏，原生质体外泄，表现出溶菌现象（图2）。

2.2 B-09菌株无菌发酵液对病原菌菌丝生长的抑制作用

从表1可见，B-09无菌发酵液在5.0%的浓度下对菌丝生长有抑制作用，但效果不明显；在14%、20%浓度下的抑菌效果较好，且二者没有显著差异。表明分无菌发酵液在14%的浓度下已能有效抑制病原菌菌丝的生长。

3 讨论与结论

近年来，某些国家正在逐渐淘汰化学农药，越来越多采用生物农药和生物肥料等生物防治措施控制和消灭植物病虫害，并取得了显著进展[8-9]。生物农药包括细菌农药、真菌农药、病毒农药和抗生素农药四大类。由于生物农药具有选择性强、效率高、成本低、不污染环境、对人畜无害等特点，某些国家正越来越多地将其应用于农作物防病、治虫、防草等方面，推广应用前景广泛。

生防菌B-09是从200余个人参土壤根际菌中经过反复筛选后获得的抗菌活性很强的菌株。试验结果表明，供试菌株的活菌体能够良好地抑制人参灰霉病病原菌菌丝的生长能力；菌株的无菌发酵液对人参灰霉病病原菌菌丝生长与孢子萌发均表现出显著的抑制作用。在温室盆栽试验中，B-09无菌发酵液对人参灰霉病的防治效果达到78.6%，与常用化学农药效果相当，但温室是一个相对可控的系统，影响因素相对于田间要少，菌株B-09虽然具有一定开发为生物农药的潜力，但防控效果还需要进一步进行田间试验来验证。

参考文献：

[1]杨春澍.药用植物学[M]. 上海：上海科学技术出版社，1998：251-252.

[2]徐怀友，马友德，张 辉，等. 人参灰霉病安全高效防治药剂组合筛选研究[J]. 吉林农业大学学报，2008，30（专辑）：44-47.

3]李小俊，成丽霞，吴彦彬，等. 拮抗菌抗菌谱及发酵液拮抗能力测定的新方法[J]. 生物技术，2007，17（1）：55-58.

[4]方中达. 植病研究方法[M]. 北京：中国农业出版社，1998：152.

[5]Brunner K，Zeilinger S，Ciliento R，et al. Improvement of the Fungal Biocontrol Agent Trichoderma atroviride to Enhance both Antagonism and Induction of Plant Systemic Disease Resistance[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（7）：3959-3962.

[6]农业部农药检定所. 农药田间药效试验准则（一）[M]. 北京：中国标准出版社. 1998：45-51.

[7]王存兴，李光武. 植物病理学[M]. 北京：化学工业出版社. 2012：92-94.

[8]陈志谊，张荣胜. 植物病害生防芽孢杆菌研究进展[J]. 江苏农业学报，2012，28（5）：999-1006.

[9]杨敬辉，吉沐祥，文平兰，等. 黄麻链霉菌NF0919菌株对水稻纹枯病的生防活性[J]. 江苏农业学报，2012，28（6）：1288-1293.