王瑞等

摘要：为筛选防治猕猴桃溃疡病的有效药剂，采用抑菌圈法，测定乙蒜素分别与溴硝醇、代森锰锌 2 种药剂复配对丁香假单胞杆菌的联合毒力，并筛选出最佳组配。结果表明，乙蒜素与溴硝醇以 1 ∶ 5 的比例复配增效作用最好，EC50为0.001 mg/mL，共毒系数为214.7，低于农用链霉素（EC50为0.004 mg/mL）；乙蒜素与与代森锰锌以1 ∶ 3复配时也具有增效作用，EC50为0.005 mg/mL，共毒系数为205.7。

关键词：乙蒜素；溴硝醇；代森锰锌；丁香假单胞杆菌；复配；增效作用

中图分类号： S481+.9 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0071-03

由丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae pv. actinidia）引起的猕猴桃溃疡病是一种毁灭性的细菌性病害。近年来，该病害来势凶猛、危害猖獗，常造成猕猴桃果园毁灭，给猕猴桃产业造成极大的损失。2010年以来，中国、法国、新西兰、西班牙、土耳其、韩国、意大利等国家种植猕猴桃相继大规模暴发溃疡病，并确认致病菌为丁香假单胞杆菌[1-7]。贵州省修文县自2008年以来大力发展猕猴桃种植业，2011年该县猕猴桃被国家工商总局核准为地理标志证明商标；预计到2015年，全县猕猴桃面积计划发展到2 000 hm2，产量3万t以上。该病害在修文县也存在暴发趋势，严重影响了该地区猕猴桃产业健康发展[8]。目前，国内外研究者对猕猴桃溃疡病的防治主要集中于农业防治、化学防治和生物防治3个方面，其中最有效的方法为化学防治。但国内外对于该病害的药剂防治主要依赖于铜制剂和链霉素，这些药剂长期使用和不规范使用易使病原菌产生抗药性，导致防治效果下降[9]。化学药剂的合理复配使用不仅可以起到提高防效、扩大防治谱的效果，还可达到有效延缓病原菌抗药性和降低成本的目的[10]。笔者所在课题组在前期商品药剂筛选工作中发现，乙蒜素、溴硝醇、代森锰锌3种农药在室内毒力和田间防治中效果较好。乙蒜素是一种高效、低毒、低残留的有机硫广谱内吸性杀菌剂，是中国首创的具有仿生结构的绿色农药，对水稻、黄瓜、棉花、油菜等作物的稻瘟病、枯萎病、霜霉病、角斑病等病害防治效果良好，且残留量低[10-11]。溴硝醇是一种溴代硝基醇类广谱杀菌剂，具有很高的杀菌活性、很低的使用浓度以及较宽的pH值使用范围，是美国食品药物管理局（FDA）批准使用的化妆品防腐剂之一，在农业生产中也得到广泛使用[12]。与上述2种农药相似，代森锰锌也为一种广谱、低毒、低残留、高效、不易产生抗性的保护性杀菌剂，并已用于猕猴桃溃疡病的防治[13]。本研究在前期工作的基础上，将修文县境内猕猴桃植株患处分离、纯化并经菌落PCR、DNA测序和比对，得到溃疡病致病菌丁香假单胞杆菌。以此为靶标，测定乙蒜素、溴硝醇和代森锰锌单剂和不同比例复配药剂室内毒力，从而筛选出最佳活性的组配，为猕猴桃种植业中溃疡病的繁殖提供长效、高效药剂。

1 材料与方法

1.1 供试药剂

供试药剂包括80%代森锰锌可湿性粉剂（美国陶氏益农公司）；30%乙蒜素乳油（浙江平湖农药厂）；20%溴硝醇可湿性粉剂（辽宁省丹东市农药总厂）。对照药剂为72%硫酸链霉素（四川普惠生物工程有限公司）。

1.2 供试菌种

参照方中达的方法[14]，于2012年3月从贵州省贵阳市修文益众农场发病植株患处取样；通过选择性培养、分离、纯化、保存；使用16S rRNA进行菌落PCR，得到16S rRNA序列，通过在美国国立生物技术信息中心（NCBI）基因库Blast比对，获得高同源性序列，根据搜索的高同源性序列可知目标菌种属于丁香假单胞杆菌属，从而得到靶标。

1.3 供试培养基

NA培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂18.0 g，经蒸馏水定容至1 000 mL，pH值调为 6.8～7.0，121 ℃湿热灭菌20 min备用。

1.4 试验方法

1.4.1 药剂处理 乙蒜素、溴硝醇、代森锰锌、乙蒜素 ∶ 溴硝醇（1 ∶ 5、1 ∶ 3、1 ∶ 1、3 ∶ 1、5 ∶ 1）以及乙蒜素 ∶ 代森锰锌（1 ∶ 5、1 ∶ 3、1 ∶ 1、3 ∶ 1、5 ∶ 1）。单剂和复配制剂均设为125、0.625、0.4167、0.3125、0.25、0.2083 mg/mL 等6个浓度梯度，每个浓度设3个平行，另设清水为空白对照，农用链霉素为对照。

1.4.2 测定方法 采用抑菌圈法测定单剂、复配剂对丁香假单胞杆菌的室内毒力。用无菌水配置含病原菌细胞100万～1 000万/mL 的菌悬液，每皿加入菌悬液1.5 mL，倒入约 12 mL 冷却的NA培养基，摇匀后制成平板。将直径为6 mm的消毒滤纸片放入各药液内浸泡1 h，取出，放入平皿中，以无菌水浸泡滤纸为对照（CK），置于28 ℃下培养，每处理重复3次。48 h后观察，测量抑菌圈直径，计算抑制率[15]，将抑制率换算成抑制概率，以药剂浓度为横坐标、以抑制概率为纵坐标作回归直线，得到各药剂对猕猴桃溃疡致病菌的毒力回归方程及抑制中浓度（EC50）。

3 结论

在前期大量药剂筛选过程中发现，乙蒜素、代森锰锌和溴硝醇对修文地区猕猴桃溃疡病致病菌具有较高的生物活性。本研究从该地区因长期使用农用链霉素而产生抗性问题、增加防控药剂的角度出发，将乙蒜素、代森锰锌、溴硝醇进行复配，以农用链霉素为对照进行室内生物活性筛选，结果表明，乙蒜素与代森锰锌配比为 1 ∶ 3、乙蒜素与溴硝醇配比为1 ∶ 5对引起猕猴桃溃疡病的假单胞杆菌具有较好的生物活性，其EC50分别为0.005、0.001 mg/L，这2种复配剂共毒系数分别为205.7、214.7，所得结果经Wadley法[17]进一步验证，表现出了明显的增效作用；而农用链霉素的EC50为 0.004 mg/mL。从室内活性筛选的结果可知，筛选出的复配剂对假单胞杆菌具有优异的效果，有望代替硫酸链霉素对猕猴桃溃疡病的防治。本研究为猕猴桃溃疡病的田间防治奠定了良好的基础，可为猕猴桃溃疡病的大田防治提供参考，进一步的田间试验正在进行中。

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