赵念力等

摘要：将引进的俄罗斯高效大豆根瘤菌GF菌株在YMA、TY、PA、BSE、SM 5种培养基中进行培养，相关生长情况的试验结果表明，该菌株在YMA培养基中生长较快。在YMA培养基中进行的碳源利用试验表明，在葡萄糖为碳源的培养基中根瘤菌生长得最好。按L9（34）正交设计表对YMA培养基中的4个组分比例进行优化，对结果进行分析可得最优的培养基配方（1 L）为：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.01 g CaCl2，去离子水补足至1 000 mL。

关键词：俄罗斯大豆根瘤菌；培养基；优化

中图分类号： Q93-335 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0069-02

根瘤菌与豆科植物能形成共生的固氮体系，在自然界中，这个体系不但具有最高的固氮效率，而且具有最多的固氮量[1]。大豆根瘤菌与大豆共生可以形成根瘤，能将空气中的氮固定转化成为大豆可以直接吸收利用的铵。大豆与根瘤菌的共生固氮作用既能直接改善大豆的氮素营养状况、提高大豆的产量和品质，又能将更多的固定氮素释放到土壤中，从而起到培肥地力的作用[2]。目前，接种根瘤菌剂已经成为世界各国豆科作物增产、减少化肥施用的一项技术措施，在许多国家都有大规模商品菌剂的生产和出售，应用面积也不断扩大。随着无公害农业的发展，接种高效大豆根瘤菌将产生更显著的社会与环境效益[3]。俄罗斯对根瘤菌的研究已有近百年的历史，具有了一定的理论基础并积累了丰富的实践经验[4-5]。2009年黑龙江省农业科学院从全俄大豆科学研究所引进了十多个高效大豆固氮根瘤菌株，并结合黑龙江省的生态环境特点和大豆主栽品种进行综合研究、开发和应用。大豆根瘤菌通常选用YMA培养基进行分离培养，但其生长较慢，不适合在生产上加以应用，因此有必要研究、改良培养基配方，选择最适合俄罗斯大豆根瘤菌生长的培养基配方，提高大豆根瘤菌的培养速度。本研究主要通过优化俄罗斯高效大豆根瘤菌培养基，筛选出最适合根瘤菌生长的培养基配方，为实现高密度发酵培养提供基础和依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

试验菌株为引进的俄罗斯大豆根瘤菌GF菌株，为大豆快生根瘤菌，由俄罗斯全俄大豆科学研究所提供。

1.2 培养基

试验用培养基有YMA、SM、TY、PA、BSE 5种，配方如下。（1）YMA培养基（1 L）：10 g甘露醇/蔗糖，1 g酵母粉，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.05 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh 微量元素液（将5 g H3BO3、5 g Na2MnO4溶解于1 000 mL去离子水中制成），加去离子水至1 000 mL，调节pH值6.8～7.0。（2）SM培养基（1 L）：10 g甘露醇，0.5 g K2HPO4，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.1 g NaCl，0.5 g KNO3，0.1g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，1 mL混合维生素液（将10 mg硫胺、10 mg烟酰胺、10 mg泛酸钙、1 mg生物素溶解于100 mL去离子水中制成），加去离子水至1 000 mL，调节pH值6.8～7.0。（3）TY培养基（1 L）：5 g胰蛋白胨，3 g酵母粉，1.3 g CaCl2 ·6H2O，加入去离子水至1 000 mL，调节pH值为7.0。（4）PA培养基（1 L）：2 g蛋白胨，0.5 g MgSO4 ·7H2O，加入去离子水至1 000 mL，调节pH值 6.8～7.0。（5）BSE培养基（1 L）：10 g甘露醇，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.1 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，加入去离子水至1 000 mL。

1.3 试验方法

1.3.1 根瘤菌菌种的活化、传代、接种 将根瘤菌在斜面培养基上28 ℃的条件下培养2 d后接种到YMA培养液中，再置于28 ℃、150 r/min的摇床中振荡培养4 d，制成接种液。

1.3.2 根瘤菌的培养 将培养好的接种液按照体积比1%的接种量接入5种液体培养基中，250 mL三角瓶的装液量为100 mL，在28 ℃、150 r/min的摇床中培养。

1.3.3 培养基的比较 在600 nm下测定不同培养时间的吸光度，绘制大豆根瘤菌在5种培养基中的生长曲线。

1.3.4 不同碳源的筛选试验 在培养基选择试验的基础上，进一步在生长较好的培养基上进行碳源的筛选试验。用等量的甘油、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖替换YMA培养基中的甘露醇，同时保持其他成分不变。接种根瘤菌于液体培养基上，接种量为1%，于28 ℃、150 r/min的条件下振荡培养，分别在培养12、24、36、48h时测定D600 nm。

1.3.5 培养基的优化 在常规培养基的基础上对大豆根瘤菌的培养基进行进一步优化。进行碳源筛选之后，采用L9（34） 正交设计方案对培养基的主要营养成分进行优化，正交设计见表1。

3 结论

通过对5种培养基的筛选表明，YMA培养基较适于俄罗斯大豆根瘤菌GF菌株的生长。碳源利用试验表明，葡萄糖为最优碳源。正交试验得到GF菌株的最优培养基配方为：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4 ·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.05 g CaCl2+4 mL Rh微量元素液，加水补至1 000 mL。优化的根瘤菌YMA培养基在避免资源浪费和降低生产成本的前提下，实现了根瘤菌的大量、快速生长，为根瘤菌工业生产奠定了基础[6]。

参考文献：

[1]刘保平，周俊初. 根瘤菌菌剂研究[J]. 湖北农业科学，2006，45（1）：57-61.

[2]谭 娟. 接种俄罗斯大豆根瘤菌对大豆生长和产量的影响[J]. 作物杂志，2007（4）：36-37.

[3]李阜棣，胡正嘉. 微生物肥料在持续发展农业中的应用[M]. 北京：中国科技出版社，1994.

[4]张 武. 俄罗斯大豆根瘤菌与不同大豆品种的生态适应性[J]. 作物杂志，2010（3）：54-55.

[5]李艳杰. 接种大豆根瘤菌对大豆生长及产量的影响[J]. 黑龙江农业科学，2013（1）：50-53.

[6]吴红慧，周俊初. 根瘤菌培养基的优化和剂型的比较研究[J]. 微生物学通报，2004，31（2）：14-19.

摘要：将引进的俄罗斯高效大豆根瘤菌GF菌株在YMA、TY、PA、BSE、SM 5种培养基中进行培养，相关生长情况的试验结果表明，该菌株在YMA培养基中生长较快。在YMA培养基中进行的碳源利用试验表明，在葡萄糖为碳源的培养基中根瘤菌生长得最好。按L9（34）正交设计表对YMA培养基中的4个组分比例进行优化，对结果进行分析可得最优的培养基配方（1 L）为：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.01 g CaCl2，去离子水补足至1 000 mL。

关键词：俄罗斯大豆根瘤菌；培养基；优化

中图分类号： Q93-335 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0069-02

根瘤菌与豆科植物能形成共生的固氮体系，在自然界中，这个体系不但具有最高的固氮效率，而且具有最多的固氮量[1]。大豆根瘤菌与大豆共生可以形成根瘤，能将空气中的氮固定转化成为大豆可以直接吸收利用的铵。大豆与根瘤菌的共生固氮作用既能直接改善大豆的氮素营养状况、提高大豆的产量和品质，又能将更多的固定氮素释放到土壤中，从而起到培肥地力的作用[2]。目前，接种根瘤菌剂已经成为世界各国豆科作物增产、减少化肥施用的一项技术措施，在许多国家都有大规模商品菌剂的生产和出售，应用面积也不断扩大。随着无公害农业的发展，接种高效大豆根瘤菌将产生更显著的社会与环境效益[3]。俄罗斯对根瘤菌的研究已有近百年的历史，具有了一定的理论基础并积累了丰富的实践经验[4-5]。2009年黑龙江省农业科学院从全俄大豆科学研究所引进了十多个高效大豆固氮根瘤菌株，并结合黑龙江省的生态环境特点和大豆主栽品种进行综合研究、开发和应用。大豆根瘤菌通常选用YMA培养基进行分离培养，但其生长较慢，不适合在生产上加以应用，因此有必要研究、改良培养基配方，选择最适合俄罗斯大豆根瘤菌生长的培养基配方，提高大豆根瘤菌的培养速度。本研究主要通过优化俄罗斯高效大豆根瘤菌培养基，筛选出最适合根瘤菌生长的培养基配方，为实现高密度发酵培养提供基础和依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

试验菌株为引进的俄罗斯大豆根瘤菌GF菌株，为大豆快生根瘤菌，由俄罗斯全俄大豆科学研究所提供。

1.2 培养基

试验用培养基有YMA、SM、TY、PA、BSE 5种，配方如下。（1）YMA培养基（1 L）：10 g甘露醇/蔗糖，1 g酵母粉，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.05 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh 微量元素液（将5 g H3BO3、5 g Na2MnO4溶解于1 000 mL去离子水中制成），加去离子水至1 000 mL，调节pH值6.8～7.0。（2）SM培养基（1 L）：10 g甘露醇，0.5 g K2HPO4，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.1 g NaCl，0.5 g KNO3，0.1g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，1 mL混合维生素液（将10 mg硫胺、10 mg烟酰胺、10 mg泛酸钙、1 mg生物素溶解于100 mL去离子水中制成），加去离子水至1 000 mL，调节pH值6.8～7.0。（3）TY培养基（1 L）：5 g胰蛋白胨，3 g酵母粉，1.3 g CaCl2 ·6H2O，加入去离子水至1 000 mL，调节pH值为7.0。（4）PA培养基（1 L）：2 g蛋白胨，0.5 g MgSO4 ·7H2O，加入去离子水至1 000 mL，调节pH值 6.8～7.0。（5）BSE培养基（1 L）：10 g甘露醇，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.1 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，加入去离子水至1 000 mL。

1.3 试验方法

1.3.1 根瘤菌菌种的活化、传代、接种 将根瘤菌在斜面培养基上28 ℃的条件下培养2 d后接种到YMA培养液中，再置于28 ℃、150 r/min的摇床中振荡培养4 d，制成接种液。

1.3.2 根瘤菌的培养 将培养好的接种液按照体积比1%的接种量接入5种液体培养基中，250 mL三角瓶的装液量为100 mL，在28 ℃、150 r/min的摇床中培养。

1.3.3 培养基的比较 在600 nm下测定不同培养时间的吸光度，绘制大豆根瘤菌在5种培养基中的生长曲线。

1.3.4 不同碳源的筛选试验 在培养基选择试验的基础上，进一步在生长较好的培养基上进行碳源的筛选试验。用等量的甘油、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖替换YMA培养基中的甘露醇，同时保持其他成分不变。接种根瘤菌于液体培养基上，接种量为1%，于28 ℃、150 r/min的条件下振荡培养，分别在培养12、24、36、48h时测定D600 nm。

1.3.5 培养基的优化 在常规培养基的基础上对大豆根瘤菌的培养基进行进一步优化。进行碳源筛选之后，采用L9（34） 正交设计方案对培养基的主要营养成分进行优化，正交设计见表1。

3 结论

通过对5种培养基的筛选表明，YMA培养基较适于俄罗斯大豆根瘤菌GF菌株的生长。碳源利用试验表明，葡萄糖为最优碳源。正交试验得到GF菌株的最优培养基配方为：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4 ·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.05 g CaCl2+4 mL Rh微量元素液，加水补至1 000 mL。优化的根瘤菌YMA培养基在避免资源浪费和降低生产成本的前提下，实现了根瘤菌的大量、快速生长，为根瘤菌工业生产奠定了基础[6]。

参考文献：

[1]刘保平，周俊初. 根瘤菌菌剂研究[J]. 湖北农业科学，2006，45（1）：57-61.

[2]谭 娟. 接种俄罗斯大豆根瘤菌对大豆生长和产量的影响[J]. 作物杂志，2007（4）：36-37.

[3]李阜棣，胡正嘉. 微生物肥料在持续发展农业中的应用[M]. 北京：中国科技出版社，1994.

[4]张 武. 俄罗斯大豆根瘤菌与不同大豆品种的生态适应性[J]. 作物杂志，2010（3）：54-55.

[5]李艳杰. 接种大豆根瘤菌对大豆生长及产量的影响[J]. 黑龙江农业科学，2013（1）：50-53.

[6]吴红慧，周俊初. 根瘤菌培养基的优化和剂型的比较研究[J]. 微生物学通报，2004，31（2）：14-19.

摘要：将引进的俄罗斯高效大豆根瘤菌GF菌株在YMA、TY、PA、BSE、SM 5种培养基中进行培养，相关生长情况的试验结果表明，该菌株在YMA培养基中生长较快。在YMA培养基中进行的碳源利用试验表明，在葡萄糖为碳源的培养基中根瘤菌生长得最好。按L9（34）正交设计表对YMA培养基中的4个组分比例进行优化，对结果进行分析可得最优的培养基配方（1 L）为：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.01 g CaCl2，去离子水补足至1 000 mL。

关键词：俄罗斯大豆根瘤菌；培养基；优化

中图分类号： Q93-335 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0069-02

根瘤菌与豆科植物能形成共生的固氮体系，在自然界中，这个体系不但具有最高的固氮效率，而且具有最多的固氮量[1]。大豆根瘤菌与大豆共生可以形成根瘤，能将空气中的氮固定转化成为大豆可以直接吸收利用的铵。大豆与根瘤菌的共生固氮作用既能直接改善大豆的氮素营养状况、提高大豆的产量和品质，又能将更多的固定氮素释放到土壤中，从而起到培肥地力的作用[2]。目前，接种根瘤菌剂已经成为世界各国豆科作物增产、减少化肥施用的一项技术措施，在许多国家都有大规模商品菌剂的生产和出售，应用面积也不断扩大。随着无公害农业的发展，接种高效大豆根瘤菌将产生更显著的社会与环境效益[3]。俄罗斯对根瘤菌的研究已有近百年的历史，具有了一定的理论基础并积累了丰富的实践经验[4-5]。2009年黑龙江省农业科学院从全俄大豆科学研究所引进了十多个高效大豆固氮根瘤菌株，并结合黑龙江省的生态环境特点和大豆主栽品种进行综合研究、开发和应用。大豆根瘤菌通常选用YMA培养基进行分离培养，但其生长较慢，不适合在生产上加以应用，因此有必要研究、改良培养基配方，选择最适合俄罗斯大豆根瘤菌生长的培养基配方，提高大豆根瘤菌的培养速度。本研究主要通过优化俄罗斯高效大豆根瘤菌培养基，筛选出最适合根瘤菌生长的培养基配方，为实现高密度发酵培养提供基础和依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

试验菌株为引进的俄罗斯大豆根瘤菌GF菌株，为大豆快生根瘤菌，由俄罗斯全俄大豆科学研究所提供。

1.2 培养基

试验用培养基有YMA、SM、TY、PA、BSE 5种，配方如下。（1）YMA培养基（1 L）：10 g甘露醇/蔗糖，1 g酵母粉，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.05 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh 微量元素液（将5 g H3BO3、5 g Na2MnO4溶解于1 000 mL去离子水中制成），加去离子水至1 000 mL，调节pH值6.8～7.0。（2）SM培养基（1 L）：10 g甘露醇，0.5 g K2HPO4，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.1 g NaCl，0.5 g KNO3，0.1g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，1 mL混合维生素液（将10 mg硫胺、10 mg烟酰胺、10 mg泛酸钙、1 mg生物素溶解于100 mL去离子水中制成），加去离子水至1 000 mL，调节pH值6.8～7.0。（3）TY培养基（1 L）：5 g胰蛋白胨，3 g酵母粉，1.3 g CaCl2 ·6H2O，加入去离子水至1 000 mL，调节pH值为7.0。（4）PA培养基（1 L）：2 g蛋白胨，0.5 g MgSO4 ·7H2O，加入去离子水至1 000 mL，调节pH值 6.8～7.0。（5）BSE培养基（1 L）：10 g甘露醇，0.2 g MgSO4 ·7H2O，0.5 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.1 g CaCl2 ·6H2O，4 mL Rh微量元素液，加入去离子水至1 000 mL。

1.3 试验方法

1.3.1 根瘤菌菌种的活化、传代、接种 将根瘤菌在斜面培养基上28 ℃的条件下培养2 d后接种到YMA培养液中，再置于28 ℃、150 r/min的摇床中振荡培养4 d，制成接种液。

1.3.2 根瘤菌的培养 将培养好的接种液按照体积比1%的接种量接入5种液体培养基中，250 mL三角瓶的装液量为100 mL，在28 ℃、150 r/min的摇床中培养。

1.3.3 培养基的比较 在600 nm下测定不同培养时间的吸光度，绘制大豆根瘤菌在5种培养基中的生长曲线。

1.3.4 不同碳源的筛选试验 在培养基选择试验的基础上，进一步在生长较好的培养基上进行碳源的筛选试验。用等量的甘油、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖替换YMA培养基中的甘露醇，同时保持其他成分不变。接种根瘤菌于液体培养基上，接种量为1%，于28 ℃、150 r/min的条件下振荡培养，分别在培养12、24、36、48h时测定D600 nm。

1.3.5 培养基的优化 在常规培养基的基础上对大豆根瘤菌的培养基进行进一步优化。进行碳源筛选之后，采用L9（34） 正交设计方案对培养基的主要营养成分进行优化，正交设计见表1。

3 结论

通过对5种培养基的筛选表明，YMA培养基较适于俄罗斯大豆根瘤菌GF菌株的生长。碳源利用试验表明，葡萄糖为最优碳源。正交试验得到GF菌株的最优培养基配方为：10.0 g葡萄糖+0.8 g酵母粉+0.2 g MgSO4 ·7H2O+0.8 g K2HPO4+0.1 g NaCl+0.05 g CaCl2+4 mL Rh微量元素液，加水补至1 000 mL。优化的根瘤菌YMA培养基在避免资源浪费和降低生产成本的前提下，实现了根瘤菌的大量、快速生长，为根瘤菌工业生产奠定了基础[6]。

参考文献：

[1]刘保平，周俊初. 根瘤菌菌剂研究[J]. 湖北农业科学，2006，45（1）：57-61.

[2]谭 娟. 接种俄罗斯大豆根瘤菌对大豆生长和产量的影响[J]. 作物杂志，2007（4）：36-37.

[3]李阜棣，胡正嘉. 微生物肥料在持续发展农业中的应用[M]. 北京：中国科技出版社，1994.

[4]张 武. 俄罗斯大豆根瘤菌与不同大豆品种的生态适应性[J]. 作物杂志，2010（3）：54-55.

[5]李艳杰. 接种大豆根瘤菌对大豆生长及产量的影响[J]. 黑龙江农业科学，2013（1）：50-53.

[6]吴红慧，周俊初. 根瘤菌培养基的优化和剂型的比较研究[J]. 微生物学通报，2004，31（2）：14-19.