花婧等

摘要：大小蠹属昆虫是重要的林木害虫，大部分种类是检疫性有害生物，我国口岸有多次截获记录。为加强对大小蠹属害虫的检疫鉴定，通过线粒体DNA细胞色素氧化酶C亚基Ⅰ基因（COⅠ）867 bp片段序列对大小蠹属17个种类进行序列分析，结果表明，线粒体COⅠ基因可作为大小蠹属昆虫分类的依据；DNA条形码是生物系统分类分子水平上的依据。

关键词：大小蠹属；线粒体基因；遗传距离；COⅠ基因

中图分类号： S763.380.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0030-03

目前，世界范围内已报道大小蠹属（Dendroctonus）昆虫19种[1-2]，作为鞘翅目中最进化的1个类群，其危害范围较广，是重要的森林害虫。大小蠹属为树皮小蠹类[3-4]，全部种类均侵食树干，成虫时初入侵韧皮部，后筑母坑道于形成层与边材之间。一般情况下，大小蠹属只危害活的直立木和由于年龄、干旱或其他生物学因素导致的衰弱木，在盛发期也危害茁壮的健康树，寄主包括松属、云杉属、黄杉属和落叶松属等经济树种。

目前，昆虫鉴定以传统的形态学鉴定为主，该方法存在一定的缺陷，表型可塑性（phenotypic plasticity）和遗传可变性（genetic variability）容易造成鉴定结果不正确，无法鉴定许多群体中普遍存在的隐存分类单元，受生物性别和发育阶段的限制，很多生物无法被鉴定。现代交互式鉴定系统是昆虫鉴定的一个很大进步，但它要求专业技术很高，操作不正确就易导致鉴定错误[5]。快速准确的物种鉴定是深入开展行为学、生态学以及生理学等相关研究的必要前提和基础[6]。

国内外大小蠹研究多集中于形态学分类，有关该类群分子鉴定技术的研究报道尚少。本研究通过对大小蠹属COⅠ基因片段序列进行比对，对同源序列碱基多样性及系统进化关系进行分析，以期利用DNA条形码技术快速、准确地鉴定大小蠹种类，为进一步研究小蠹科昆虫分子鉴定技术提供理论依据和实践基础。

1 材料与方法

1.1 昆虫种类及序列信息

本研究以大小蠹属17个种类作为研究对象（表1），序列均从GenBank下载。

1.2 分析方法

应用MEGA5.05软件进行序列比对、拼接和剪切，基于Kimura 2-parameter模型，计算各分类单元之间的遗传距离及其标准差、序列碱基组成、保守位点、变异位点、转换/颠换比值等[7]。应用MEGA5.05软件，使用邻接法（NJ）构建分子系统树，1 000次循环估计系统树中节点的自举置信水平，碱基转换和颠换赋予相同的加权值，查看系统树[8]。

2 结果与分析

2.1 mtDNA COⅠ基因序列组成和变异

应用MEGA 5.05软件对17个大小蠹COⅠ基因序列比

对剪齐后保留了869 bp的序列，其中第1个碱基为第1个氨基酸密码子的启示位点，为分析方便，共保留867 bp进行序列分析。结果表明，在867个位点中没有插入和缺失现象，其中保守位点、变异位点和简约信息位点分别为525个、342个和248个，在867个位点中分别占60.6%、39.4%和286%；A、T、C、G平均含量分别为30.2%、37.9%、16.8%、15.1%，A+T含量较高，为68.1%。另外，虽然不同密码子的A、T、C、G含量不相同，但都表现出明显的A+T含量偏向性，特别是在密码子的第3位，A+T含量高达83.1%，与典型的昆虫线粒体DNA碱基组成一致。密码子第3位点G含量较少，只有4.6%，并且在不同种间差异较大（2.1%～74%），C含量在不同种群间差异也很大（6.4%～20.9%）。

2.2 碱基替换分析

采用MEGA5.05软件对所测基因序列替换数进行估计，由表2可见，17种大小蠹COⅠ基因867个核苷酸序列中，核苷酸替换多为同义替换（ii）。全组数据转换与颠换的平均比值为1.79，在第1、2、3位点的比值分别为3.63、1.68、1.58，转换较为频繁，这是昆虫mtDNA的一个普遍特点；转换发生以CT为主（73.0%），颠换以AT为主（933%）。转换与颠换主要发生在密码子第3位点上，转换58个，其频率为总数的77.3%，颠换37个，其频率为总数的881%；第2位点最少，只有2个位点发生了转换，1个位点发生了颠换，这与第3位点承担较小的遗传压力有关。

2.3 遗传距离分析

在分子进化过程中，多重替换的存在严重干扰了序列之间真正的遗传距离估算，很难直接从已对准的序列中计算出真正的遗传距离。要解决这个问题，就需要对多重替换影响下的序列进行校正。现在有一些方法对序列进化过程作出了不同的假设，在这些假设条件下来估计序列上核苷酸的替换数目。参数越多，对进化过程的描述就越具体和详细，相对计算也越复杂。

基于Kimura 2-parameter，采用MEGA5.05软件分析大小蠹属17种昆虫之间的遗传距离[9]，并采用Bootstrap重抽样1 000次进行检验。由表3可见，大小蠹属17种昆虫平均遗传距离为0.145，属间遗传距离介于0.083～0.191之间（>2%）。虽然大小蠹属各物种之间的亲缘关系十分接近，但可以达到分子水平不同种的鉴定要求。

2.4 大小蠹属NJ系统发育重建

以楝星天牛（Anoplophora horsfieldi）为外群，采用MEGA5.05构建大小蠹属17个种的NJ分子系统树，从构建的NJ树（图1）来看，华山松大小蠹、杰松大小蠹、山松大小蠹聚为1支，科罗大小蠹、西部松大小蠹、间大小蠹、墨西哥大小蠹、南部松大小蠹聚为1支，黄杉大小蠹和落叶松大小蠹聚为1支，根大小蠹、红脂大小蠹、黑脂大小蠹聚为1支，剩余几种聚为1支，形成5大支格局。其中，华山松大小蠹、杰松大小蠹、山松大小蠹一支分化最快，依次为南部松大小蠹所在支、黄杉大小蠹和落叶松大小蠹所在支、根大小蠹所在支，云杉大小蠹所在支分化最慢，这与形态学分类相一致。如山松大小蠹与杰松大小蠹、黄杉松大小蠹和落叶松大小蠹在形态学上相似，在分子系统进化树上也同样关系相近，且从遗传距离（表2）看，两者的遗传距离分别为0.083和0.092（>2%），说明该段序列能够作为分子鉴定的依据。

3 小结与讨论

Hebert等对包括脊椎动物和无脊椎动物界的COⅠ基因序列比较分析，得出除腔肠动物外、98%物种的种内遗传距离差异为0%～2%的结论。本研究各种大小蠹昆虫间的遗传距离表明，该片段在种间平均距离为0.145，可以较好区分大小蠹属的不同种类。同时，基于Kimura 2-parameter双参数模型构建的NJ树结果与形态学分类结果基本一致，能满足种类鉴定的需要。

本研究利用NCBI中已公开的部分大小蠹COⅠ序列，通过线粒体COⅠ基因序列比较，分析各种间遗传距离及系统进化树构建，发现利用该段序列能够较好地区分近缘种，且与形态学分类相似度高，证实了基于线粒体COⅠ基因的DNA条形码技术在小蠹科大小蠹属昆虫分子鉴定上具有可行性，既能够解决植物检疫中截获的大小蠹幼虫或残缺成虫的鉴定问题，又能为小蠹科昆虫DNA条形码数据库的构建提供理论依据及实践基础。

参考文献：

[1]Wood S L. The bark and ambrosia beetles of north and central America（Coleoptera：Scolytidae），a taxonomic monograph[M]. Prove：Brigham Young University，1982.

[2]殷惠芬，黄复生，李兆麟. 中国经济昆虫志 第29册：鞘翅目小蠹科[M]. 北京：科学出版社，1984：56-58.

[3]Diaze E，Cisnerosr R，Zunigag G，et al. Comparative anatomical and histological study of the alimentary canal of Dendroctonus parallelocollis，D. rhizophagus，and D. valens（Coleoptera：Scolytidae）[J]. Annals of Entomological Society of America，1998，91（4）：479-487.

[4]Hopkins A D. Contributions toward a monograph of the scolytid beetles[M]. USDA：Bureau of Entomology Technical Bulletin，1909.

[5]刘 勇，宋 毓，李晓宇. 基于线粒体COⅠ基因的DNA条形码技术在昆虫分子鉴定中的应用[J]. 植物检疫，2010，24（2）：46-50.

[6]Dayrat B. Towards integrative taxonomy[J]. Biol J Linn Soc，2005，85（3）：407-415.

[7]蒋 青，梁忆冰，王乃扬，等. 有害生物危险性评价的定量分析方法研究[J]. 植物检疫，1995，9（4）：208-211.

[8]田 鹏，刘占林. 分子系统发育树构建的简易方法[J]. 生物信息学，2009，7（3）：232-233.

[9]李 培. 缘蝽科昆虫线粒体COⅠ基因的分子系统学研究（半翅目：异翅亚目）[D]. 西安：陕西师范大学，2007：1-57.

3 小结与讨论

Hebert等对包括脊椎动物和无脊椎动物界的COⅠ基因序列比较分析，得出除腔肠动物外、98%物种的种内遗传距离差异为0%～2%的结论。本研究各种大小蠹昆虫间的遗传距离表明，该片段在种间平均距离为0.145，可以较好区分大小蠹属的不同种类。同时，基于Kimura 2-parameter双参数模型构建的NJ树结果与形态学分类结果基本一致，能满足种类鉴定的需要。

本研究利用NCBI中已公开的部分大小蠹COⅠ序列，通过线粒体COⅠ基因序列比较，分析各种间遗传距离及系统进化树构建，发现利用该段序列能够较好地区分近缘种，且与形态学分类相似度高，证实了基于线粒体COⅠ基因的DNA条形码技术在小蠹科大小蠹属昆虫分子鉴定上具有可行性，既能够解决植物检疫中截获的大小蠹幼虫或残缺成虫的鉴定问题，又能为小蠹科昆虫DNA条形码数据库的构建提供理论依据及实践基础。

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[3]Diaze E，Cisnerosr R，Zunigag G，et al. Comparative anatomical and histological study of the alimentary canal of Dendroctonus parallelocollis，D. rhizophagus，and D. valens（Coleoptera：Scolytidae）[J]. Annals of Entomological Society of America，1998，91（4）：479-487.

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[6]Dayrat B. Towards integrative taxonomy[J]. Biol J Linn Soc，2005，85（3）：407-415.

[7]蒋 青，梁忆冰，王乃扬，等. 有害生物危险性评价的定量分析方法研究[J]. 植物检疫，1995，9（4）：208-211.

[8]田 鹏，刘占林. 分子系统发育树构建的简易方法[J]. 生物信息学，2009，7（3）：232-233.

[9]李 培. 缘蝽科昆虫线粒体COⅠ基因的分子系统学研究（半翅目：异翅亚目）[D]. 西安：陕西师范大学，2007：1-57.

3 小结与讨论

Hebert等对包括脊椎动物和无脊椎动物界的COⅠ基因序列比较分析，得出除腔肠动物外、98%物种的种内遗传距离差异为0%～2%的结论。本研究各种大小蠹昆虫间的遗传距离表明，该片段在种间平均距离为0.145，可以较好区分大小蠹属的不同种类。同时，基于Kimura 2-parameter双参数模型构建的NJ树结果与形态学分类结果基本一致，能满足种类鉴定的需要。

本研究利用NCBI中已公开的部分大小蠹COⅠ序列，通过线粒体COⅠ基因序列比较，分析各种间遗传距离及系统进化树构建，发现利用该段序列能够较好地区分近缘种，且与形态学分类相似度高，证实了基于线粒体COⅠ基因的DNA条形码技术在小蠹科大小蠹属昆虫分子鉴定上具有可行性，既能够解决植物检疫中截获的大小蠹幼虫或残缺成虫的鉴定问题，又能为小蠹科昆虫DNA条形码数据库的构建提供理论依据及实践基础。

参考文献：

[1]Wood S L. The bark and ambrosia beetles of north and central America（Coleoptera：Scolytidae），a taxonomic monograph[M]. Prove：Brigham Young University，1982.

[2]殷惠芬，黄复生，李兆麟. 中国经济昆虫志 第29册：鞘翅目小蠹科[M]. 北京：科学出版社，1984：56-58.

[3]Diaze E，Cisnerosr R，Zunigag G，et al. Comparative anatomical and histological study of the alimentary canal of Dendroctonus parallelocollis，D. rhizophagus，and D. valens（Coleoptera：Scolytidae）[J]. Annals of Entomological Society of America，1998，91（4）：479-487.

[4]Hopkins A D. Contributions toward a monograph of the scolytid beetles[M]. USDA：Bureau of Entomology Technical Bulletin，1909.

[5]刘 勇，宋 毓，李晓宇. 基于线粒体COⅠ基因的DNA条形码技术在昆虫分子鉴定中的应用[J]. 植物检疫，2010，24（2）：46-50.

[6]Dayrat B. Towards integrative taxonomy[J]. Biol J Linn Soc，2005，85（3）：407-415.

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[8]田 鹏，刘占林. 分子系统发育树构建的简易方法[J]. 生物信息学，2009，7（3）：232-233.

[9]李 培. 缘蝽科昆虫线粒体COⅠ基因的分子系统学研究（半翅目：异翅亚目）[D]. 西安：陕西师范大学，2007：1-57.