魏博等

摘要：对影响思茅松SRAP-PCR反应体系的各参数进行分析，建立并优化出一套适合思茅松的SRAP-PCR反应体系。在25 μL反应体系中，模板DNA 60 ng、Mg2+2.0 mmol/L、引物1.0 μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶1 U；在此基础上，从100对引物组合中筛选出条带清晰、多态性丰富的引物组合24对。

关键词：思茅松；SRAP；体系建立；引物筛选

中图分类号：S722.3 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）03-0027-03

思茅松（Pinus kesiya var. langbianensis）是我国云南省特有树种，以大面积纯林或针阔混交林的形式集中分布于云南省思茅市、临沧地区、红河州、西双版纳州和德宏州的部分县市[1]。思茅松木材广泛用于建筑、家具制造等行业；其树干富含树脂、而且品质优良，已成为除马尾松、湿地松之外我国重要的松脂资源。近年来，思茅松已成为云南省特别是滇南地区人工造林的主要树种，在云南省林业产业结构中占有重要地位[2]。

20世纪80年代思茅松的遗传改良工作就已经开展：种源试验及优良林分和种源的选择，为思茅松种子调拔区划提供科学依据；无性繁殖技术的不断改良，加速了思茅松良种化的进程[3]；优树选择及种子园的建立，为生产提供了宝贵的资源[4]。随着分子生物学的高速发展，对思茅松的研究也从宏观进入了分子水平。21世纪初思茅松的遗传多样性在同工酶水平得到了研究，并提出了相关的遗传资源保护策略[5]；随后，思茅松RAPD、ISSR、AFLP等分子标记的反应体系相继得以建立[6-8]。

SRAP分子标记技术因操作方便快速、产率高、多态性丰富、易从条带中得到分离条带等特点已经在植物遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建中得到广泛的应用[9-10]，但在思茅松中的研究未见报道。本研究的目的在于对思茅松的 SRAP-PCR 反应体系的各参数进行分析，在此基础上建立和优化一套适合思茅松的SRAP-PCR反应体系，并筛选出适合思茅松SRAP反应的引物组合，为思茅松的遗传多样性研究及遗传连锁图谱的构建提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

研究材料为云南省普洱市思茅区、景谷县、墨江县及孟连县的4个思茅松自然分布群体。从每个群体中随机采集5株长势茂盛、植株健壮的思茅松新鲜松针。采集后置于-80 ℃冰箱中备用。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和检测 采用改良的CTAB法对采集样本的基因组DNA进行提取[11]。利用琼脂糖凝胶电泳及核酸蛋白检测仪2种方法对提取的思茅松DNA进行纯度和浓度的检测。

1.2.2 引物的合成 参照Li等序列[12]，由北京华大基因科技有限公司合成引物，引物编号和序列见表1。

1.2.3 PCR扩增程序 扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，37 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，5个循环；94 ℃变性1 min，退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。

1.2.4 SRAP-PCR反应体系的优化 在25 μL的反应体系中模板DNA用量依次设置了30、45、60、75、90 ng 5个梯度；Mg2+浓度依次设置了1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L 5个梯度；dNTPs浓度依次设置了0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/L 5个梯度；Taq DNA聚合酶用量设置了0.25、0.50、0.75、100、1.25 U 5个梯度；引物浓度依次设置了0.25、0.50、075、100、1.25 μmol/L 5个梯度。反应结束后，扩增产物用 15% 琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.2.5 引物筛选 利用建立的思茅松SRAP反应体系，采用不同地区的思茅松种源对100对SRAP 引物组合（表1）进行筛选，筛选出条带清晰、带型质量好、多态性丰富的引物组合。

2 结果与分析

2.1 DNA检测

思茅松松针中含有蛋白质、松脂等不利DNA提取的杂质。琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，通过改良的CTAB法基本排除了蛋白质和其他杂质的干扰，且在RNA酶作用下，将RNA也去除干净，经过琼脂糖凝胶电泳基本能得到整齐、清晰、含杂质较少的DNA条带，所得DNA纯度高（图1）。核酸蛋白检测仪检测后，所有思茅松DNA的D260 nm/D280 nm值均在1.8～2.0之间，浓度均达到100 ng/μL以上（表2），表明其纯度和浓度均能满足思茅松SRAP-PCR反应的要求。

2.2 模板DNA用量的优化

电泳结果表明，模板DNA的用量对于PCR扩增结果影响较大，当模板DNA的用量小于60 ng时，扩增产物相对较弱，扩增出的条带模糊不清晰；当模板DNA用量为60～90 ng 时，扩增出的条带带型清晰、稳定、分辨率较高（图2）。DNA浓度过高会导致模板与引物的直接配对概率降低、模板变性不彻底而引起弥散现象。考虑到节约模板和试验操作稳定性，在25 μL体系中DNA最佳用量为60 ng。

2.3 Mg2+浓度的优化

试验结果表明，当Mg2+浓度小于1. 5 mmol/L时，扩增出的条带较弱、不清晰；当Mg2+浓度大于1.5 mmol/L时，扩增出的条带相对清晰稳定（图3）。但考虑到较高Mg2+浓度会产生非特异性扩增，产生非特异性条带，而且会出现条带不稳定的弥散现象，在保证特异性PCR产物质量较高、特异性较强的情况下，在25 μL体系中Mg2+最佳浓度为2.0 mmol/L。

2.4 dNTPs浓度的优化

试验结果表明，dNTPs的浓度小于0.15 mmol/L时，扩增条带较弱，PCR产物较少，可能是因为dNTPs过早的消耗完而使产物单链化导致扩增效果不佳。当dNTPs的浓度为 0.2 mmol/L 时，扩增的条带稳定、清晰，扩增产物较佳；当浓度为0.25、0.3 mmol/L时条带明显增亮（图4）。最终确定在25 μL体系中dNTPs最佳浓度为0.25 mmol/L。

2.5 Taq DNA聚合酶的优化

试验结果表明，Taq DNA聚合酶用量小于0.75 U时，合成产物量较少，条带扩增不明显；当用量在0.75～1.25 U 之间时，扩增的条带明亮、清晰（图5）。考虑到高用量的Taq DNA聚合酶会出现非特异性扩增现象，导致假阳性，甚至出现亮的通带，Taq DNA聚合酶用量为1 U时， 条带最清晰稳定、

扩增效果最好，所以在25 μL体系中Taq DNA聚合酶最佳浓度为1 U。

2.6 引物浓度

引物的浓度在一定程度上影响扩增产物的产量。结果表明：引物浓度在0.25～0.50 μmol/L之间时，其扩增产物产量较少，条带明显较暗。只有在1.0 μmol/L时条带清晰稳定，扩增效果最好（图6）。由于引物浓度过高会产生非特异性扩增和错配，导致引物二聚体的产生，最终确定1.0 μmol/L引物浓度为最佳反应浓度。

2.7 引物筛选

根据建立和优化的SRAP-PCR反应体系，采用4个群体共20个个体对100对SRAP引物组合进行筛选，最终筛选出Me1-Em3（图7）等24对多态性好、扩增结果稳定的引物组合（表3）。

SRAP 标记不需要知道任何基因的序列信息即可进行 PCR 扩增，具有共显性简便、稳定、操作简单、重复性强等优点，因此SRAP 技术在林木遗传育种中得到了广泛的应用，并且均取得了良好的效果。SRAP分子标记技术受到反应条件的影响，如DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+浓度以及反应程序等，因此在利用SRAP分子标记时首先应对其反应体系进行优化，以保证分析结果的可靠性。本研究对PCR反应中的各影响因子都设计了5个梯度，通过反复试验，最终确定了优化后的思茅松SRAP反应体系，该体系总体积为25 μL，其中模板DNA用量60 ng，Mg2+浓度2.0 mmol/L，引物1 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1 U。

SRAP分子标记多态性产生的原因在于上游引物与下游引物分别与外显子区域和内含子、启动子区域结合，而内含子和启动子区域在不同个体、物种中又存在差异。可见，SRAP分子标记中多态性条带的获得取决于引物与基因组的结合状态。本研究建立的SRAP-PCR反应体系，与太行菊[13]、茶树[14]、柱花草[15]、华山松[16]等都有不同，说明不同物种的SRAP-PCR反应体系有一定差异。在此基础上利用建立的思茅松SRAP-PCR体系成功地从100对引物组合中筛选出24对条带清晰、多态性丰富的引物组合。表明这套思茅松SRAP-PCR反应体系稳定、可靠，为后续的思茅松遗传多样性研究及遗传连锁图谱构建奠定了技术基础。

参考文献：

[1]耿树香，尹晓兵. 思茅松树脂酸热异构反应的研究[J]. 林业实用技术，2011（6）：58-60.

[2]陈 伟，唐社云，陈宏伟，等. 思茅松优树收集区营建关键技术[J]. 江苏农业科学，2011，39（2）：288-289.

[3]唐红燕，许玉兰，唐海英，等. 思茅松嫩枝扦插育苗技术研究[J]. 西南林业大学学报，2011，31（2）：24-28.

[4]段安安，许玉兰，王秀荣.思茅松无性系种子园雌雄球花分布特性及人工辅助授粉的研究[J]. 云南林业科技，2002，32（4）：22-26.

[5]Chen S Y，Zhao W S，Wang J. Genetic diversity and genetic differentiation of natural populations of Pinus kesiya var. langbinanensis[J]. Journal of Forestry Research，2002，13（4）：273-276.

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[7]王曙光，杨文武，普晓兰.思茅松大配子体DNA的提取及ISSR反应体系的建立[J]. 四川林业科技，2012（2）：90-95.

[8]姚鹏强，李 培，王曙光，等. 思茅松AFLP分子标记体系的建立[J]. 西南林业大学学报，2012，32（6）：30-33.

[9]周冬琴，莫海波，芦治国，等. 基于SRAP标记的墨西哥落羽杉优良单株的遗传多样性分析[J]. 植物资源与环境学报，2012，21（1）：36-41.

[10]齐 兰，王文泉，张振文，等. 利用SRAP标记构建18个木薯品种的DNA指纹图谱[J]. 作物学报，2010，36（10）：1642-1648.

[11]王大玮，李 煜，周 玮，等. 杜仲AFLP反应体系的建立及优化[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2010，38（6）：88-94.

[12]Li G，Quiors C F. Sequence-related amplified polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theoretical and Applied Genetics，2001，103：455-461.

[13]高亚卉，朱广龙，姬志峰，等. 太行菊SRAP-PCR反应体系的建立与优化[J]. 实验室科学，2012，15（1）：81-84.

[14]刘 振，赵 洋，杨培迪，等. 茶树SRAP反应体系优化及引物筛选[J]. 茶叶通讯，2012，39（4）：18-21.

[15]张伟丽，刘凤民，刘 艾. 柱花草SRAP-PCR体系优化及其遗传多样性分析[J]. 草业学报，2011，20（4）：159-168.

[16]赵 杨，李玉璞，代 毅. 华山松SRAP-PCR反应体系的优化[J]. 西北林学院学报，2012，27（5）：87-90，173.

试验结果表明，dNTPs的浓度小于0.15 mmol/L时，扩增条带较弱，PCR产物较少，可能是因为dNTPs过早的消耗完而使产物单链化导致扩增效果不佳。当dNTPs的浓度为 0.2 mmol/L 时，扩增的条带稳定、清晰，扩增产物较佳；当浓度为0.25、0.3 mmol/L时条带明显增亮（图4）。最终确定在25 μL体系中dNTPs最佳浓度为0.25 mmol/L。

2.5 Taq DNA聚合酶的优化

试验结果表明，Taq DNA聚合酶用量小于0.75 U时，合成产物量较少，条带扩增不明显；当用量在0.75～1.25 U 之间时，扩增的条带明亮、清晰（图5）。考虑到高用量的Taq DNA聚合酶会出现非特异性扩增现象，导致假阳性，甚至出现亮的通带，Taq DNA聚合酶用量为1 U时， 条带最清晰稳定、

扩增效果最好，所以在25 μL体系中Taq DNA聚合酶最佳浓度为1 U。

2.6 引物浓度

引物的浓度在一定程度上影响扩增产物的产量。结果表明：引物浓度在0.25～0.50 μmol/L之间时，其扩增产物产量较少，条带明显较暗。只有在1.0 μmol/L时条带清晰稳定，扩增效果最好（图6）。由于引物浓度过高会产生非特异性扩增和错配，导致引物二聚体的产生，最终确定1.0 μmol/L引物浓度为最佳反应浓度。

2.7 引物筛选

根据建立和优化的SRAP-PCR反应体系，采用4个群体共20个个体对100对SRAP引物组合进行筛选，最终筛选出Me1-Em3（图7）等24对多态性好、扩增结果稳定的引物组合（表3）。

SRAP 标记不需要知道任何基因的序列信息即可进行 PCR 扩增，具有共显性简便、稳定、操作简单、重复性强等优点，因此SRAP 技术在林木遗传育种中得到了广泛的应用，并且均取得了良好的效果。SRAP分子标记技术受到反应条件的影响，如DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+浓度以及反应程序等，因此在利用SRAP分子标记时首先应对其反应体系进行优化，以保证分析结果的可靠性。本研究对PCR反应中的各影响因子都设计了5个梯度，通过反复试验，最终确定了优化后的思茅松SRAP反应体系，该体系总体积为25 μL，其中模板DNA用量60 ng，Mg2+浓度2.0 mmol/L，引物1 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1 U。

SRAP分子标记多态性产生的原因在于上游引物与下游引物分别与外显子区域和内含子、启动子区域结合，而内含子和启动子区域在不同个体、物种中又存在差异。可见，SRAP分子标记中多态性条带的获得取决于引物与基因组的结合状态。本研究建立的SRAP-PCR反应体系，与太行菊[13]、茶树[14]、柱花草[15]、华山松[16]等都有不同，说明不同物种的SRAP-PCR反应体系有一定差异。在此基础上利用建立的思茅松SRAP-PCR体系成功地从100对引物组合中筛选出24对条带清晰、多态性丰富的引物组合。表明这套思茅松SRAP-PCR反应体系稳定、可靠，为后续的思茅松遗传多样性研究及遗传连锁图谱构建奠定了技术基础。

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[16]赵 杨，李玉璞，代 毅. 华山松SRAP-PCR反应体系的优化[J]. 西北林学院学报，2012，27（5）：87-90，173.

试验结果表明，dNTPs的浓度小于0.15 mmol/L时，扩增条带较弱，PCR产物较少，可能是因为dNTPs过早的消耗完而使产物单链化导致扩增效果不佳。当dNTPs的浓度为 0.2 mmol/L 时，扩增的条带稳定、清晰，扩增产物较佳；当浓度为0.25、0.3 mmol/L时条带明显增亮（图4）。最终确定在25 μL体系中dNTPs最佳浓度为0.25 mmol/L。

2.5 Taq DNA聚合酶的优化

试验结果表明，Taq DNA聚合酶用量小于0.75 U时，合成产物量较少，条带扩增不明显；当用量在0.75～1.25 U 之间时，扩增的条带明亮、清晰（图5）。考虑到高用量的Taq DNA聚合酶会出现非特异性扩增现象，导致假阳性，甚至出现亮的通带，Taq DNA聚合酶用量为1 U时， 条带最清晰稳定、

扩增效果最好，所以在25 μL体系中Taq DNA聚合酶最佳浓度为1 U。

2.6 引物浓度

引物的浓度在一定程度上影响扩增产物的产量。结果表明：引物浓度在0.25～0.50 μmol/L之间时，其扩增产物产量较少，条带明显较暗。只有在1.0 μmol/L时条带清晰稳定，扩增效果最好（图6）。由于引物浓度过高会产生非特异性扩增和错配，导致引物二聚体的产生，最终确定1.0 μmol/L引物浓度为最佳反应浓度。

2.7 引物筛选

根据建立和优化的SRAP-PCR反应体系，采用4个群体共20个个体对100对SRAP引物组合进行筛选，最终筛选出Me1-Em3（图7）等24对多态性好、扩增结果稳定的引物组合（表3）。

SRAP 标记不需要知道任何基因的序列信息即可进行 PCR 扩增，具有共显性简便、稳定、操作简单、重复性强等优点，因此SRAP 技术在林木遗传育种中得到了广泛的应用，并且均取得了良好的效果。SRAP分子标记技术受到反应条件的影响，如DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+浓度以及反应程序等，因此在利用SRAP分子标记时首先应对其反应体系进行优化，以保证分析结果的可靠性。本研究对PCR反应中的各影响因子都设计了5个梯度，通过反复试验，最终确定了优化后的思茅松SRAP反应体系，该体系总体积为25 μL，其中模板DNA用量60 ng，Mg2+浓度2.0 mmol/L，引物1 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1 U。

SRAP分子标记多态性产生的原因在于上游引物与下游引物分别与外显子区域和内含子、启动子区域结合，而内含子和启动子区域在不同个体、物种中又存在差异。可见，SRAP分子标记中多态性条带的获得取决于引物与基因组的结合状态。本研究建立的SRAP-PCR反应体系，与太行菊[13]、茶树[14]、柱花草[15]、华山松[16]等都有不同，说明不同物种的SRAP-PCR反应体系有一定差异。在此基础上利用建立的思茅松SRAP-PCR体系成功地从100对引物组合中筛选出24对条带清晰、多态性丰富的引物组合。表明这套思茅松SRAP-PCR反应体系稳定、可靠，为后续的思茅松遗传多样性研究及遗传连锁图谱构建奠定了技术基础。

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