龙石太等

摘要：参照GenBank已公布的绵羊BMP2基因序列与牛BMP4基因序列分别设计一对引物，以川中黑山羊卵巢总RNA为模板，采用RT-PCR技术扩增川中黑山羊BMP2基因和BMP4基因的cDNA序列并进行克隆、测序及相关生物信息学分析。结果表明，川中黑山羊BMP2基因编码区全长为1 188 bp（GenBank登录号为KF492982），BMP4基因编码区全长为1 230 bp（GenBank登录号为KF492983），分别编码395、409个氨基酸。川中黑山羊与绵羊、牛、猪、人、马、鼠、鸡BMP2基因编码区序列的同源性分别为99.7%、98.7%、92.0%、89.6%、91.4%、86.1%、78.9%；川中黑山羊与绵羊、牛、猪、人、马、鼠、鸡BMP4基因编码区序列的同源性分别为99.3%、99.1%、95.9%、95.2%、94.4%、920%、80.1%。用MEGA 4.0构建物种间分子系统进化树，结果显示，BMP2基因和BMP4基因的聚类反应基本一致，川中黑山羊首先与绵羊聚类，再分别与牛、猪、马、人和鼠聚类，最后与鸡聚类，这与动物分类学基本吻合。

关键词：川中黑山羊；BMP2基因；BMP4基因；克隆；生物信息学

中图分类号：S827.2 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）03-0019-04

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是转化生长因子β（TGF-β）超家族中最大的亚族，是Urist等于1965年从脱钙骨基质中分离得到的一种有活性的蛋白质，并利用该蛋白质成功诱导了异位成骨[1]，所以命名为骨形态发生蛋白。许多研究表明，BMPs不仅能诱导骨及软骨的形成、分化，而且能影响脊椎动物的神经细胞、造血组织、眼睛、肾和上皮附属器官的形成、器官发生以及组织定型与重塑等[2]。BMPs在动物大部分组织中均有表达，在机体的许多生命活动中发挥作用，所以关于BMPs的研究越来越受到重视。有研究发现，BMPs与雌性动物的繁殖机能相关，通过旁分泌/自分泌调节作用对卵巢进行调节，从而调节卵泡发育[3-4]。也有研究表明，BMP4可以促进小鼠原始卵泡的形成及原始卵泡发育为初级卵泡[5]。BMP2、BMP4、BMP6 和BMP7 蛋白可抑制绵羊颗粒细胞分泌孕酮，但不会影响绵羊颗粒细胞增殖和存活[6]，BMP2蛋白可抑制雌二醇与孕酮的合成及cAMP的释放[7]，BMP4蛋白可抑制绵羊垂体细胞FSH释放[8]，由此推测，BMP2与BMP4可能是多羔动物的黄体抑制剂。BMPs还与早期胚胎的细胞凋亡与增殖密切相关，对细胞分化与器官发生、发育具有重要意义，BMP2、BMP4位点的丢失均可导致动物胚胎性死亡[9-10]，是胚胎发育过程中必不可少的信号分子[11-12]。

川中黑山羊是经过长期自然选择和人工重点培育而成的多胎山羊品种，它具有性成熟早（母羊初情期为3～4月龄，初配年龄为5～6月龄）、产仔率高（平均产羔率为270%）、生长速度快、产肉性能好、耐粗食、抗病力强、适应性良好等优点。为进一步阐明川中黑山羊多胎的分子生物学基础，本研究克隆了川中黑山羊BMP2、BMP4基因完整编码区，与 GenBank 已公布的其他物种进行序列比对，并在此基础上构建物种间分子系统进化树。到目前为止，有关山羊BMP2与BMP4在生物信息学方面的研究尚未见报道，所以本研究采用生物信息学方法分析这2个基因及其氨基酸序列的理化性质、结构特征等，旨在为进一步开展川中黑山羊BMP2、BMP4基因的结构功能、遗传变异、表达调控以及繁殖性状的相关分析等研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验动物

在四川省乐至县天龙科技示范园选取6只3～5岁的健康川中黑山羊，在其发情后12～24 h（发情期中期）屠宰，立即采集卵巢等组织，迅速在室温下的生理盐水中冲洗3次，置于盛有RNA later的EP管中，迅速投入到液氮中保存，带回实验室保存于超低温冰箱（-80 ℃）中备用。

1.2 试剂和载体

川中黑山羊组织总RNA提取试剂盒、2×Taq PCR MasterMix、感受态细胞均购自天根生化科技（北京）有限公司，反转录试剂盒购自Fermentas（MBI）公司，X-Gal、IPTG、氨苄青霉素、克隆载体PMD-19 Vector购自宝生物工程（大连）有限公司，DNA胶回收试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司。

1.3 卵巢总RNA的提取

用动物组织总RNA提取试剂盒（离心柱型）提取川中黑山羊卵巢总RNA。

1.4 cDNA第一链的合成

用反转录试剂盒进行cDNA第一链合成。

1.5 引物设计及PCR扩增目的基因

参照绵羊BMP2基因（GenBank登录号XM_004014353）设计1对引物（F：5′-AGAAGGAAGAGGCGAAGGAAGG-3′，R：5′-TGCTGTGCTAACGACACCCAC-3′），扩增片段全长1 331 bp。参照牛的BMP4基因（GenBank登录号为NM_001045877）的mRNA序列，用软件Primer Premier 5设计1对引物（F：5′-ATGATTCCTGGTAACCGAATGC-3′，R：5′-AGGGATGTGGTTGCCGCTGA-3′），扩增片段全长 1 230 bp。引物序列送往上海英俊生物工程有限公司合成。

以合成的卵巢cDNA第一链为模板，扩增BMP2、BMP4基因，PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，58 ℃ 退火40 s（BMP2）/62 ℃退火40 s（BMP4），72 ℃延伸 80 s，35个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。产物用 15 g/L 琼脂糖凝胶电泳，再用凝胶成像系统进行检测、拍照。

1.6 克隆及重组子筛选和鉴定

PCR产物经电泳检测后，按DNA胶回收试剂盒说明进行胶回收，回收产物与PMD-19载体连接，置于金属浴中16 ℃过夜。连接反应产物转化宿主菌5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体平板上，37 ℃培养过夜。挑选白色单克隆菌落于LB液体培养基中37 ℃振荡培养12 h，取菌液作PCR进行阳性重组子鉴定，并提取重组质粒。

1.7 生物信息学分析

1.7.1 核酸序列分析 测序完成后获得上下游序列，利用DNAman软件进行序列拼接，并根据测序峰图调整。从NCBI上查找相关物种的BMP2、BMP4基因序列，保存备用。用NCBI在线程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找ORF，确定CDS区，并将CDS区翻译成氨基酸序列。

1.7.2 蛋白质序列分析 用ProtParam程序（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白质的一级结构及其理化参数（分子量、等电点、分子式等）；用ProtScal程序（http：//expasy.org/tools/protscale.html）分析疏水性；用TMHMM Server v2.0程序（http：//genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）进行跨膜区预测；用SignalP 4.0 Server程序（http：//genome.cbs.D tu.dk/ser-vices/SignalP/）预测信号肽；用PSORT程序（http：//psort.hgc.jp/form.html）预测亚细胞定位；用GOR程序（http：//npsa- pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa automat.pl？ page =npsa_ gor4.html）预测蛋白质二级结构；用Phyre2程序（http：//www.sbg.bio.ic.ac. uk/phyre2/html/page.cgi？id =index）预测蛋白质三级结构。

2 结果与分析

2.1 川中黑山羊总RNA提取

从提取的RNA中取4 μL进行RNA纯度和完整性的检测。用1.5%琼脂糖凝胶在150 V下电泳15 min，结果如图1所示。图1显示，28S和18S RNA均比较完整，条带明亮，说明所提取的总RNA是完整的，可用于下一步试验。

2.2 PCR扩增结果

吸取PCR产物各4 μL，对其进行电泳检测。用1%琼脂

糖凝 胶电泳检测条带，结果如图2所示，其中BMP2基因的目的条带与预期大小1 331 bp基本一致，BMP4基因的目的条带与预期大小1 230 bp基本一致，且目的条带明亮，可以进行下一步胶回收试验。

2.3 川中黑山羊BMP2、BMP4基因CDS区的核苷酸序列及其特征

用DNAman软件对测序所得序列进行序列比对、拼接，去除载体序列后，得到BMP2基因1 331 bp，BMP4基因 1 230 bp，与预期一致。用NCBI ORF Finder查找其开放性阅读框，并翻译出氨基酸序列。将川中黑山羊BMP2、BMP4基因序列提交给GenBank，登录号分别为KF492982、KF492983。

通过DNAman分析川中黑山羊与其他物种BMP2、BMP4基因CDS区的核苷酸序列同源性，结果显示，川中黑山羊BMP2基因的CDS区核苷酸序列与绵羊（XM_004014353）、牛（NM_001099141）、猪（NM_001195399）、人（NM_001200）、马（XM_514508）、鼠（NM_007553）和鸡（NM_204358）相应序列间的一致性分别为99.7%、98.7%、92.0%、89.6%、91.4%、86.1%、78.9%；川中黑山羊BMP4基因的CDS区核苷酸序列与绵羊（NM_001110277）、牛（NM_0 01045877）、猪（NM_001101031）、人（NM_130850）、马（XM_003314330）和鼠（NM_007554）相应序列间的一致性分别为99.3%、99.1%、959%、95.2%、94.4%、92.0%、80.1%。说明在不同物种间这2个基因具有较高的一致性，属于较保守的基因之一。

利用DNAman、ClustalX、MEGA 4.0对相应物种的BMP2、BMP4基因编码区进行多序列一致性比对，计算出遗传距离，并构建基因Neighbor-Joining（NJ）系统发生树（图3、图4）。从图3、图4可以看出，川中黑山羊与绵羊亲缘关系最近，其次是牛，与鸡的亲缘关系最远，这与遗传距离和核苷酸同源性比对的结果一致。

2.4 川中黑山羊BMP2、BMP4蛋白的结构特征

Prot Param分析结果表明，川中黑山羊BMP2、BMP4蛋白的分子式分别为C1974H3097N581O568S16、C2050H3214N616O598S16，相对分子质量分别为44 569.8、46 570.8，理论等电点PI分别为8.96、8.11，半衰期都为30 h，不稳定参数分别为54.83、5754，二者均属不稳定蛋白；脂肪系数依次为79.49、80.05，疏水性平均数依次为-0.423、-0.545，预测BMP2、BMP4蛋白均为亲水性蛋白。结合ProScale程序分析结果可知，川中黑山羊BMP2蛋白共有9个高亲水区，BMP4蛋白有10个高亲水区，这是蛋白进化中氨基酸插入的主要位点。而在这2个蛋白的N段都存在明显的疏水区，可能是信号肽。通过SignalP 3.0服务器进行信号肽预测，结果显示，在BMP2基因编码的氨基酸序列第23～24（甘氨酸-亮氨酸）位点可能存在信号肽位点，该多肽N端存在信号肽的概率为0.837；BMP4多肽N端存在信号肽的概率为0.793，信号肽位点可能位于第24位点与第25位点（丙氨酸至丝氨酸）之间，二者属分泌型蛋白。

通过在线程序TMHMM 2.0进行跨膜区分析，BMP2和BMP4 都只存在1个跨膜区，且跨膜区都位于信号肽位置，结合对信号肽的考虑可知，这2个基因编码的成熟肽都没有跨膜区。TargetP亚细胞定位预测结果显示，BMP2成熟蛋白位于细胞外的概率是0.728，BMP4蛋白位于细胞外的概率是0785。

用GOR程序在线预测BMP2蛋白二级结构，结果显示，该蛋白包括α螺旋（127个AA残基）、β折叠（86个AA残基）、无规卷曲（182个AA残基）3种模块，分别占靶蛋白的32.15%、21.77%、46.08%。BMP4蛋白的α螺旋（127个AA残基）、β折叠（74个AA残基）、无规卷曲（208个AA残基）分别占靶蛋白的31.05%、18.09%、50.86%。

通过Phyre 2.0预测BMP2和BMP4的三级结构（图5和图6），得到BMP2靶标蛋白，其残基建模覆盖率81%（320个氨基酸残基）；BMP4靶蛋白，其残基建模覆盖率为79%（324个氨基酸残基），置信度达100%，说明靶标蛋白与模板蛋白的空间结构很接近，适合的空间结构比例很大，空间保真性很高，川中黑山羊BMP2和BMP4蛋白多处氨基酸位点具有较高的能量，处于不稳定状态，说明二者为不稳定蛋白。

3 讨论

3.1 序列比对

本研究利用PCR技术从川中黑山羊卵巢组织中克隆得到川中黑山羊BMP2、BMP4基因的cDNA序列，包含了长度为 1 188、1 230 bp的完整编码区，分别编码395、409个氨基酸。经同源性比对可知，所得序列与绵羊BMP2、BMP4基因的cDNA序列一致性分别达到99.7%、99.3%，因此可确定克隆所得序列为川中黑山羊BMP2、BMP4基因cDNA序列。与其他物种进行核苷酸序列间的同源性比对，结果表明，川中黑山羊的BMP2、BMP4基因编码区序列与其他物种同源性很高，基因序列较保守，相对而言，BMP4基因的保守性比BMP2基因更强。DNAman比对结果显示，BMP2基因编码区存在种属间特异插入或缺失，人的BMP2基因编码区长度为 1 191 bp，比川中黑山羊和牛多 3 bp，编码396个氨基酸；而鼠的BMP2基因编码区长为1 185 bp，比川中黑山羊和牛少 3 bp，编码394个氨基酸。不同物种间BMP4基因编码区也有差异，人和鼠比川中黑山羊和牛少 3 bp。不同组织来源也可能存在蛋白质前体长度的差异，如骨肉瘤表达的BMP4前体蛋白为408个氨基酸，而成熟胎盘组织中表达的BMP4前体蛋白为402个氨基酸[13]。

3.2 分子系统进化关系

川中黑山羊与绵羊、牛、人、鼠、鸡等物种间BMP2基因构建的分子系统进化树结果表明，川中黑山羊首先与绵羊聚为一类，再分别与牛、猪、马、人、鼠聚类，最后与鸡聚类，各分支置信度均在90%以上，聚类结果置信度高。由BMP4基因构建的分子系统进化树可以看出，川中黑山羊与绵羊、牛始终聚为一支，再依次与猪、人、马、鼠、鸡聚类。牛和绵羊以及猪和人在聚类时置信度分别为73%和78%，导致置信度偏低的原因在于BMP4在聚类物种间核苷酸同源性差异很小，川中黑山羊与绵羊和牛的BMP4基因核苷酸同源性分别为99.3%和99.1%。由此可以看出，BMP2基因更适用于构建物种间分子系统进化树，该分子系统进化树较准确、真实地反映了各物种间的进化关系和亲缘关系，即亲缘关系越近的物种，同源性越高，遗传距离越小。

3.3 结构与功能

川中黑山羊的BMP4基因位于第14号染色体长臂2区 2～3 带之间，由5个外显子、4个内含子组成，其 cDNA 编码区全长均1 230 bp，编码 409 个氨基酸，成熟肽为116 个氨基酸残基[14]。人的BMP2基因定位于第20号染色体短臂1区2带上，由3个外显子、2个内含子组成[15]，编码区全长 1 191 bp，编码396个氨基酸残基的多肽，其成熟肽基因为 339 bp，成熟肽包括113个氨基酸分子[16]。分析BMP2、BMP4基因的cDNA序列后发现，成熟肽基因序列均在3′端编码区内[17]，同源性比对结果也表明，3′端是BMPs的保守区。

BMP2与BMP4作为TGF-β家族的重要成员，且属于同一亚族，具有分泌型蛋白质的特征，二者氨基酸同源性高达90%，BMP2、BMP4、BMP7是BMPs家族中生物活性最高的3种蛋白[18]。BMPs晶体结构的核心是一个胱氨酸结，从核心向外延伸来自于β链和反方向的α螺旋环的2个手指样凸起，α螺旋环和β链则为手指。C端是该家族的保守区，成熟的BMPs有7个半胱氨酸，并且位置绝对保守，其中6个半胱氨酸形成分子内二硫键，另一个半胱氨酸形成分子间二硫键，借此分子间二硫键连接2条多肽形成二聚体结构[19]。与所有TGF-β家族一样，BMP2、BMP4在蛋白质合成后期氨基端的前肽区会被切除，形成具有活性的成熟肽，二聚体的形成和分子成熟的过程可能发生于细胞内或分泌过程中。因此，只有形成二聚体形式，这些蛋白质才具有生物活性，才能启动细胞的信号传导。与石晓卫等对黄淮山羊BMP4的结构与功能的分析结果[14]一致，BMP2与BMP4具有BMPs家族的典型结构特征，这些结构特征构成了它们在骨组织形成、原始卵泡发育及早期胚胎发育中发挥作用的基础[20]。

近年来，对山羊和绵羊TGF-β超家族的研究逐渐增多，大量研究表明，BMP-IB、BMP15、GDF9是影响山羊与绵羊多胎的主效基因。BMP2与BMP4作为山羊和绵羊繁殖性状候选基因的报道不多，储明星等检测到了小尾寒羊BMP4基因存在多态性，并命名为AA/AB/BB型，BB型纯合子个体产羔量比AA 型和AB型个体的平均产羔量多0.6只[21]。徐业芬等对湖羊的BMP2、BMP4、BMP6、BMP7基因的mRNA 表达水平与排卵数关系进行了研究，结果发现，这几个基因在卵巢组织中均有表达，多羔组的BMP4基因mRNA水平极显著高于单羔组，BMP4基因的mRNA表达量与湖羊排卵量呈正相关，可作为影响湖羊排卵数的候选基因进一步研究[22]。目前，已在牛、猪、鼠、鸡等多种动物卵巢中检测到BMP2、BMP4的mRNA，通过旁分泌作用控制颗粒细胞的增殖与分化，并作用于卵巢、子宫及调节生殖内分泌系统。因此，开展BMP2、BMP4基因的研究能提高雌性动物繁殖力，加快优良品种的选育，从而更加合理有效地开发利用品种资源等。

4 结论

本研究通过克隆测序获得了BMP2基因（GenBank 登录号为KF492982）与BMP4基因（GenBank 登录号为KF492983）的编码区全长cDNA序列，并运用生物信息学相关软件对所得基因序列及其推导的氨基酸序列进行分析，预测二者均有信号肽，无跨膜区，极有可能是定位于细胞外的分泌型蛋白，并预测了蛋白二级结构、三级结构，通过与其他物种进行同源性分析并构建分子系统进化树，揭示了川中黑山羊与其他物种进化的一致性，为后续研究提供了一定的理论依据。

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4 结论

本研究通过克隆测序获得了BMP2基因（GenBank 登录号为KF492982）与BMP4基因（GenBank 登录号为KF492983）的编码区全长cDNA序列，并运用生物信息学相关软件对所得基因序列及其推导的氨基酸序列进行分析，预测二者均有信号肽，无跨膜区，极有可能是定位于细胞外的分泌型蛋白，并预测了蛋白二级结构、三级结构，通过与其他物种进行同源性分析并构建分子系统进化树，揭示了川中黑山羊与其他物种进化的一致性，为后续研究提供了一定的理论依据。

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4 结论

本研究通过克隆测序获得了BMP2基因（GenBank 登录号为KF492982）与BMP4基因（GenBank 登录号为KF492983）的编码区全长cDNA序列，并运用生物信息学相关软件对所得基因序列及其推导的氨基酸序列进行分析，预测二者均有信号肽，无跨膜区，极有可能是定位于细胞外的分泌型蛋白，并预测了蛋白二级结构、三级结构，通过与其他物种进行同源性分析并构建分子系统进化树，揭示了川中黑山羊与其他物种进化的一致性，为后续研究提供了一定的理论依据。

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