张俊等

摘要：为探讨黑素皮质素受体4（melanocortin receptor-4，MC4R）基因多态性对波尔山羊生长性状的影响，对波尔山羊MC4R基因进行了克隆测序，筛选多态性位点。结果表明：MC4R胞内3环基因片段存在2个碱基颠换，分别是编码区663 bp处C/A颠换、693 bp处C/T颠换；其中693 bp处C/T存在于Csp6Ⅰ酶切位点内，以此建立了基于 Csp6Ⅰ 酶切的PCR-RFLP检测方法，并对163只波尔山羊进行检测分析；在受检波尔山羊中检测到CC、CT 2种基因型，2种基因型在波尔山羊各月龄体重方面差异均不显著，且在群体中表现为低度多态，群体遗传杂合度较低，表明C693T位点在波尔山羊群体中的遗传一致性较高。

关键词：黑素皮质素受体4；克隆；PCR-RFLP；波尔山羊；生长

中图分类号： Q343.1+5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0013-03

黑素皮质素受体-4（melanocortin receptor-4，MC4R）分布于动物脑组织和肾上腺髓质，是从动物下丘脑腹内侧核分泌的一种肽类物质[1]，其主要作用是通过与脑部分泌的天然内源配体α-促黑激素（α-Melanocyte stimulating hormone，α-MSH）结合，从而抑制体重增加[2]。1993年Gantz等最先克隆出人的MC4R基因，并将其定位于人染色体18q21.3[3]。1997年Huszar等首次证明了MC4R在能量平衡中的关键作用，即遗传敲除MC4R基因的小鼠出现遗传性肥胖，表现多食、肥胖、胰岛素分泌过多等症状[4-5]。此后又有大量研究发现，MC4R在家畜的背膘厚、日增重、采食量等生长性状中具有重要生物学活性，可作为选择动物生长性状的遗传标记。本研究对波尔山羊MC4R基因进行了克隆和测序，寻找波尔山羊MC4R基因的多态性位点，分析其多态性与波尔山羊体重的关联，以期为山羊分子育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

163只波尔山羊样本由江苏省农业科学院六合动物实验基地统一饲养管理，营养水平以及管理水平保持一致。各月龄波尔山羊体重资料均由该基地提供。对各个体采集耳组织样，置冰桶中带回实验室，-20 ℃保存。

1.2 组织DNA提取

组织样DNA的提取采用酚/仿抽提法，TE Buffer 溶解后-20 ℃保存。

1.3 MC4R基因扩增

根据GenBank：EU622853.2设计引物。上游引物序列：TCCAAGTGATGCCGACCAG，下游引物序列：CTGGGCACTGCTTCACATC。PCR反应总体系20 μL，含模板DNA 60 ng，5 U/L Taq聚合酶0.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，10 μmol/L引物各0.6 μL，25 mmol/L MgCl2 1.2 μL，10×缓冲液2 μL，添加灭菌双蒸水至20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.4 克隆与测序

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，随机选取10只波尔山羊的PCR产物用TaKaRa胶回收试剂盒回收后与 PMD-19T 载体连接，16 ℃培养过夜，转化到大肠杆菌感受态细胞中，37 ℃培养16 h，挑阳性克隆送上海英骏公司测序。

1.5 突变位点筛选

将11个阳性克隆的测序结果与GenBank序列对比，确定突变位点。

1.6 PCR-RFLP分析

1.6.1 目的基因扩增 根据测序结果选择其中一个突变位点（位于Csp6Ⅰ识别序列内），设计1对引物扩增MC4R基因Csp6Ⅰ位点上游158 bp，下游80 bp，共238 bp序列，上游引物序列为GTGTCGGGCGTCTTGTTC，下游引物序列为AGCAGACGACGAAGACCC。PCR反应总体系为20 μL，含模板DNA 60 ng，5 U/L Taq聚合酶0.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，10 μmol/L引物各0.6 μL，25 mmol/L MgCl2 1.2 μL，10×缓冲液2 μL，添加灭菌双蒸水至20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸 15 s，35个循环。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色检测扩增结果。

1.6.2 基因型的确定 采用Csp6Ⅰ对PCR扩增产物进行酶切。酶切反应体系16 μL，含PCR产物4 μL，10 U/L Csp6Ⅰ0.5 μL，10×缓冲液1 μL，灭菌双蒸水10.5 μL。37 ℃酶切 3 h。均用3%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，EB染色，培清JS-780全自动凝胶成像分析仪进行成像分析。CC基因型得到238 bp的1个片段，CT基因型得到80、158、238 bp等3个片段。

1.7 数据分析

对不同基因型的山羊体重体尺资料采用SPSS软件的 Independent-Samples T Test工具进行关联分析。

2 结果与分析

2.1 MC4R基因片段的扩增

对10只波尔山羊DNA模板分别进行MC4R基因片段PCR扩增，在1 400 bp左右得到1条特异性条带（图1），与预期结果一致。

2.2 测序筛选多态位点

将10只波尔山羊DNA模板扩增得到的MC4R基因片段克隆后进行测序，测序结果表明在MC4R胞内3环基因片段发现2个点突变，663 bp处C/A单碱基颠换（图2），693 bp处C/T单碱基颠换（图3）。经分析693 bp处C/T 变异处于Csp6Ⅰ酶切位点内。

2.3 PCR-RFLP检测方法的建立

对163只波尔山羊样本进行PCR扩增，在238 bp左右得

到1条特异性条带（图4），与预期结果一致。采用限制性内切酶Csp6Ⅰ对PCR扩增产物进行消化，结果出现2种基因型，分别命名为CC、CT。CC基因型得到238 bp 1个片段（图5，泳道2、3）；CT基因型得到238、158、80 bp 3个片段（图5，泳道1、4）。

2.4 MC4R基因群体遗传学分析

2.4.1 基因型频率在波尔山羊群体中的分布 在163只受试波尔山羊中，以CC基因型居多，占78.5%；CT基因型较少，占21.5%（表1）；C为优势基因。

2.4.2 遗传特性分析 由表1可见，C693T位点在波尔山羊群体中均表现为低度多态[多态信息含量（PIC）<0.25）]，而且群体遗传杂合度较低，表明该多态位点在波尔山羊群体中的选择潜力不大，遗传一致性较高。

2.5 不同基因型对波尔山羊体重的影响

对受检波尔山羊C693T位点2种基因型的山羊体重进行t检验，结果表明各月龄山羊体重差异均不显著（表2）。

3 结论与讨论

大量研究表明，MC4R基因在动物采食和能量平衡调控中起关键作用，目前已发现猪、牛、兔、犬、鸡等动物的MC4R基因存在与体重性状相关的SNPs。Kim等首次报道MC4R基因Asp298Asn突变与猪的背膘厚、生长速度、采食量显著相关[6]。刘洪瑜等发现，牛的MC4R基因1069 C/G突变显著影响了体斜长及胸围[7]。蒋美山等对兔MC4R基因237 bp处A/G突变的研究显示，该位点显著影响兔体重、全净膛重、饲料转化率[8]。张轶博等发现，比格犬MC4R基因226 bp处的C/A变异与体重显著相关[9]。仇雪梅等发现，MC4R基因5′调控区和编码区的4个突变对鸡体重、屠体性状有显著影响[10]。曾献存等发现，不同MC4R基因的中国美利奴羊体斜长和腰角宽差异显著[11]。但山羊MC4R基因多态性及其与生产性状关联分析未见报道。

已有研究显示，MC4R的胞内3环对于MC4R与G蛋白的偶联活性十分重要[12]。通过克隆测序，本研究发现波尔山羊MC4R胞内3环基因片段存在2个SNPs，即C663A、C693T，均为无义突变，不引起氨基酸的改变。其中693 bp处的C/T单碱基颠换导致产生限制性内切酶Csp6Ⅰ识别位点，据此建立了该SNP位点的PCR-RFLP检测方法。通过对163只波尔山羊检测发现，只检测出2种基因型，以CC型居多，CT型较少，C为优势基因。t检验表明，检测出的2种基因型在受检波尔山羊各月龄体重方面差异均不显著，且该位点在波尔山羊群体中表现为低度多态（PIC<0.25），说明其在波尔山羊群体中的选择潜力不大。但该位点在波尔山羊群体中是否均只存在2种基因型及其对体重的影响，以及C663A位点对体重、体尺性状的影响，还须要进一步研究。

参考文献：

[1]Yeo G S，Farooqi I S，Challis B G，et al. The role of melanocortin signalling in the control of body weight：evidence from human and murine genetic models[J]. QJM：Monthly Journal of the Association of Physicians，2000，93（1）：7-14.

[2]Sinha P S，Schioth H B，Tatro J B. Roles of the melanocortin-4 receptor in antipyretic and hyperthermic actions of centrally administered alpha-MSH[J]. Brain Research，2004，1001（1/2）：150-158.

[3]Gantz I，Miwa H，Konda Y，et al. Molecular cloning，expression，and gene localization of a fourth melanocortin receptor[J]. The Journal of Biological Chemistry，1993，268（20）：15174-15179.

[4]Huszar D，Lynch C A，Fairchild-Huntress V，et al. Targeted disruption of the melanocortin-4 receptor results in obesity in mice[J]. Cell，1997，88（1）：131-141.

[5]方晓敏，孟摇翠，任守文，等. 6个主效基因在苏钟猪分子育种中的应用价值[J]. 江苏农业学报，2012，28（5）：1074-1078.

[6]Kim K S，Larsen N，Short T，et al. A missense variant of the porcine melanocortin-4 receptor （MC4R） gene is associated with fatness，growth，and feed intake traits[J]. Mammalian Genome，2000，11（2）：131-135.

[7]刘洪瑜，王 恒，任春环，等. 牛MC4R基因多态性与体尺性状的相关分析[J]. 中国兽医学报，2012，32（9）：1309-1311，1343.

[8]蒋美山，陈仕毅，赖松家，等. 兔黑素皮质素受体4（MC4R）基因多态性及其与体重及屠体性状的关联研究[J]. 遗传，2008，30（12）：1574-1578.

[9]张轶博，巴彩凤，苏玉虹，等. 比格犬MC4R基因多态性与体重相关性的研究[J]. 遗传，2006，28（10）：1224-1228.

[10]仇雪梅，李 宁，邓学梅，等. 鸡MC4R基因的SNPs及其与屠体性状的相关研究[J]. 中国科学：C辑，2006，36（2）：127-133.

[11]曾献存，陈韩英，贾 斌，等. MC4R和PROP1基因多态性及合并基因型与中国美利奴羊生长性状的关联分析[J]. 畜牧兽医学报，2011，42（9）：1227-1232.

[12]Kim D H，Shin S W，Baik J H. Role of third intracellular loop of the melanocortin 4 receptor in the regulation of constitutive activity[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，365（3）：439-445.

2.3 PCR-RFLP检测方法的建立

对163只波尔山羊样本进行PCR扩增，在238 bp左右得

到1条特异性条带（图4），与预期结果一致。采用限制性内切酶Csp6Ⅰ对PCR扩增产物进行消化，结果出现2种基因型，分别命名为CC、CT。CC基因型得到238 bp 1个片段（图5，泳道2、3）；CT基因型得到238、158、80 bp 3个片段（图5，泳道1、4）。

2.4 MC4R基因群体遗传学分析

2.4.1 基因型频率在波尔山羊群体中的分布 在163只受试波尔山羊中，以CC基因型居多，占78.5%；CT基因型较少，占21.5%（表1）；C为优势基因。

2.4.2 遗传特性分析 由表1可见，C693T位点在波尔山羊群体中均表现为低度多态[多态信息含量（PIC）<0.25）]，而且群体遗传杂合度较低，表明该多态位点在波尔山羊群体中的选择潜力不大，遗传一致性较高。

2.5 不同基因型对波尔山羊体重的影响

对受检波尔山羊C693T位点2种基因型的山羊体重进行t检验，结果表明各月龄山羊体重差异均不显著（表2）。

3 结论与讨论

大量研究表明，MC4R基因在动物采食和能量平衡调控中起关键作用，目前已发现猪、牛、兔、犬、鸡等动物的MC4R基因存在与体重性状相关的SNPs。Kim等首次报道MC4R基因Asp298Asn突变与猪的背膘厚、生长速度、采食量显著相关[6]。刘洪瑜等发现，牛的MC4R基因1069 C/G突变显著影响了体斜长及胸围[7]。蒋美山等对兔MC4R基因237 bp处A/G突变的研究显示，该位点显著影响兔体重、全净膛重、饲料转化率[8]。张轶博等发现，比格犬MC4R基因226 bp处的C/A变异与体重显著相关[9]。仇雪梅等发现，MC4R基因5′调控区和编码区的4个突变对鸡体重、屠体性状有显著影响[10]。曾献存等发现，不同MC4R基因的中国美利奴羊体斜长和腰角宽差异显著[11]。但山羊MC4R基因多态性及其与生产性状关联分析未见报道。

已有研究显示，MC4R的胞内3环对于MC4R与G蛋白的偶联活性十分重要[12]。通过克隆测序，本研究发现波尔山羊MC4R胞内3环基因片段存在2个SNPs，即C663A、C693T，均为无义突变，不引起氨基酸的改变。其中693 bp处的C/T单碱基颠换导致产生限制性内切酶Csp6Ⅰ识别位点，据此建立了该SNP位点的PCR-RFLP检测方法。通过对163只波尔山羊检测发现，只检测出2种基因型，以CC型居多，CT型较少，C为优势基因。t检验表明，检测出的2种基因型在受检波尔山羊各月龄体重方面差异均不显著，且该位点在波尔山羊群体中表现为低度多态（PIC<0.25），说明其在波尔山羊群体中的选择潜力不大。但该位点在波尔山羊群体中是否均只存在2种基因型及其对体重的影响，以及C663A位点对体重、体尺性状的影响，还须要进一步研究。

参考文献：

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[7]刘洪瑜，王 恒，任春环，等. 牛MC4R基因多态性与体尺性状的相关分析[J]. 中国兽医学报，2012，32（9）：1309-1311，1343.

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[10]仇雪梅，李 宁，邓学梅，等. 鸡MC4R基因的SNPs及其与屠体性状的相关研究[J]. 中国科学：C辑，2006，36（2）：127-133.

[11]曾献存，陈韩英，贾 斌，等. MC4R和PROP1基因多态性及合并基因型与中国美利奴羊生长性状的关联分析[J]. 畜牧兽医学报，2011，42（9）：1227-1232.

[12]Kim D H，Shin S W，Baik J H. Role of third intracellular loop of the melanocortin 4 receptor in the regulation of constitutive activity[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，365（3）：439-445.

2.3 PCR-RFLP检测方法的建立

对163只波尔山羊样本进行PCR扩增，在238 bp左右得

到1条特异性条带（图4），与预期结果一致。采用限制性内切酶Csp6Ⅰ对PCR扩增产物进行消化，结果出现2种基因型，分别命名为CC、CT。CC基因型得到238 bp 1个片段（图5，泳道2、3）；CT基因型得到238、158、80 bp 3个片段（图5，泳道1、4）。

2.4 MC4R基因群体遗传学分析

2.4.1 基因型频率在波尔山羊群体中的分布 在163只受试波尔山羊中，以CC基因型居多，占78.5%；CT基因型较少，占21.5%（表1）；C为优势基因。

2.4.2 遗传特性分析 由表1可见，C693T位点在波尔山羊群体中均表现为低度多态[多态信息含量（PIC）<0.25）]，而且群体遗传杂合度较低，表明该多态位点在波尔山羊群体中的选择潜力不大，遗传一致性较高。

2.5 不同基因型对波尔山羊体重的影响

对受检波尔山羊C693T位点2种基因型的山羊体重进行t检验，结果表明各月龄山羊体重差异均不显著（表2）。

3 结论与讨论

大量研究表明，MC4R基因在动物采食和能量平衡调控中起关键作用，目前已发现猪、牛、兔、犬、鸡等动物的MC4R基因存在与体重性状相关的SNPs。Kim等首次报道MC4R基因Asp298Asn突变与猪的背膘厚、生长速度、采食量显著相关[6]。刘洪瑜等发现，牛的MC4R基因1069 C/G突变显著影响了体斜长及胸围[7]。蒋美山等对兔MC4R基因237 bp处A/G突变的研究显示，该位点显著影响兔体重、全净膛重、饲料转化率[8]。张轶博等发现，比格犬MC4R基因226 bp处的C/A变异与体重显著相关[9]。仇雪梅等发现，MC4R基因5′调控区和编码区的4个突变对鸡体重、屠体性状有显著影响[10]。曾献存等发现，不同MC4R基因的中国美利奴羊体斜长和腰角宽差异显著[11]。但山羊MC4R基因多态性及其与生产性状关联分析未见报道。

已有研究显示，MC4R的胞内3环对于MC4R与G蛋白的偶联活性十分重要[12]。通过克隆测序，本研究发现波尔山羊MC4R胞内3环基因片段存在2个SNPs，即C663A、C693T，均为无义突变，不引起氨基酸的改变。其中693 bp处的C/T单碱基颠换导致产生限制性内切酶Csp6Ⅰ识别位点，据此建立了该SNP位点的PCR-RFLP检测方法。通过对163只波尔山羊检测发现，只检测出2种基因型，以CC型居多，CT型较少，C为优势基因。t检验表明，检测出的2种基因型在受检波尔山羊各月龄体重方面差异均不显著，且该位点在波尔山羊群体中表现为低度多态（PIC<0.25），说明其在波尔山羊群体中的选择潜力不大。但该位点在波尔山羊群体中是否均只存在2种基因型及其对体重的影响，以及C663A位点对体重、体尺性状的影响，还须要进一步研究。

参考文献：

[1]Yeo G S，Farooqi I S，Challis B G，et al. The role of melanocortin signalling in the control of body weight：evidence from human and murine genetic models[J]. QJM：Monthly Journal of the Association of Physicians，2000，93（1）：7-14.

[2]Sinha P S，Schioth H B，Tatro J B. Roles of the melanocortin-4 receptor in antipyretic and hyperthermic actions of centrally administered alpha-MSH[J]. Brain Research，2004，1001（1/2）：150-158.

[3]Gantz I，Miwa H，Konda Y，et al. Molecular cloning，expression，and gene localization of a fourth melanocortin receptor[J]. The Journal of Biological Chemistry，1993，268（20）：15174-15179.

[4]Huszar D，Lynch C A，Fairchild-Huntress V，et al. Targeted disruption of the melanocortin-4 receptor results in obesity in mice[J]. Cell，1997，88（1）：131-141.

[5]方晓敏，孟摇翠，任守文，等. 6个主效基因在苏钟猪分子育种中的应用价值[J]. 江苏农业学报，2012，28（5）：1074-1078.

[6]Kim K S，Larsen N，Short T，et al. A missense variant of the porcine melanocortin-4 receptor （MC4R） gene is associated with fatness，growth，and feed intake traits[J]. Mammalian Genome，2000，11（2）：131-135.

[7]刘洪瑜，王 恒，任春环，等. 牛MC4R基因多态性与体尺性状的相关分析[J]. 中国兽医学报，2012，32（9）：1309-1311，1343.

[8]蒋美山，陈仕毅，赖松家，等. 兔黑素皮质素受体4（MC4R）基因多态性及其与体重及屠体性状的关联研究[J]. 遗传，2008，30（12）：1574-1578.

[9]张轶博，巴彩凤，苏玉虹，等. 比格犬MC4R基因多态性与体重相关性的研究[J]. 遗传，2006，28（10）：1224-1228.

[10]仇雪梅，李 宁，邓学梅，等. 鸡MC4R基因的SNPs及其与屠体性状的相关研究[J]. 中国科学：C辑，2006，36（2）：127-133.

[11]曾献存，陈韩英，贾 斌，等. MC4R和PROP1基因多态性及合并基因型与中国美利奴羊生长性状的关联分析[J]. 畜牧兽医学报，2011，42（9）：1227-1232.

[12]Kim D H，Shin S W，Baik J H. Role of third intracellular loop of the melanocortin 4 receptor in the regulation of constitutive activity[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，365（3）：439-445.